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      探究蝗蟲基因的克隆與表達

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      探究蝗蟲基因的克隆與表達

      1fem-1基因在不同組織中的表達模式解剖

      羽化后1d成蟲的8個不同組織部位,包括頭、中腸、卵巢、精巢、脂肪體、體壁、早期胚胎、中期胚胎和晚期胚胎。除精巢、卵巢和胚胎外,其余樣品均為雌、雄蟲相應組織的混合樣品。雌雄蟲各3頭為1個生物學重復,各組織設3個重復,存于液氮中備用。用Trizol試劑提取總RNA,DNaseI(RNaseFree)酶解殘存的DNA,RNA電泳與定量檢測后,參照說明書以2μg的總RNA為模板進行cDNA的合成。根據fem-1基因的cDNA序列設計熒光定量PCR引物,以armadillo基因為內參,引物見表1。采用SYBRPremixExTaqTM染料,使用Eppendorf的MastercyclerePrealplex4熒光定量PCR儀進行定量分析。PCR擴增反應總體積為20μL,包括2正反向引物各0.4μL,模板cDNA0.8μL,超純水8.4μL。擴增程序為:94℃預變性2min;94℃15s,60℃15s,72℃20s,40個循環。重復3次,使用2-ΔΔCT法計算fem-1基因在不同組織的表達情況。

      2fem-1基因在精巢發育過程中的表達模式

      取5齡雄若蟲、羽化后3,6,12和24d的雄成蟲各5頭,解剖出精巢。若蟲為5齡不同時間的混合樣品。總RNA的提取、cDNA制備和定量PCR方法同1.4節。數據統計與分析采用SPSS13.0軟件對數據進行統計分析,統計數據以平均數±標準差表示。組間差異采用單因素方差(onewayANOVA)分析,兩組比較采用Studentt-test進行分析。P<0.05代表差異顯著,P<0.01代表差異極顯著。

      3結果

      以fem-1為關鍵詞搜索胚胎時期的轉錄組數據庫(未發表)的注釋信息,得到,長度分別為2625,2142和2233bp,各有一個完整的開放閱讀框。根據Unigenes設計特異性引物,分別擴增3個Unigenes的開放閱讀框,測序后獲得的序列與轉錄組數據庫中鑒定出的Unigenes的相應序列完全一致。在NCBI上在線比對后發現,這3個Unigenes編碼的氨基酸序列與其他物種的Fem-1具有較高的同源性,且具有特征性的錨蛋白重復序列模體,說明這3個Unigenes是的fem-1基因。根據同源性將這3個基因分別命名為Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c,將序列登錄到GenBank,登錄號分別為和基因的序列分析Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c基因的序列特點。BLAST分析發現Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c之間的同源性較低,Lmfem-1a與Lmfem-1b,Lmfem-1a與Lmfem-1c以及Lmfem-1b與之間的氨基酸序列一致性分別為25.55%,32.20%和35.40%,但與其他物種相應基因的同源性較高。例如,Lmfem-1a與麗蠅蛹集金小蜂Fem-1(GenBank登錄號:XP_001606383)的氨基酸序列一致性最高,達66.21%,與人體虱和赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XP_967114)的氨基酸序列一致性分別為65.12%和58.47%;Lmfem-1b與赤擬谷盜Fem-1b(XP_975561)的氨基酸序列一致性最高,為70.10%,與人Fem-1b(GenBank登錄號:NM_015322)的氨基酸序列一致性為53.43%;Lmfem-1c與赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XM_001811644)的氨基酸序列一致性最高,為63.96%,與人Fem-1c(GenBank登錄號:NM_020177)的氨基酸序列一致性為53.21%。Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c與線蟲Fem-1的氨基酸序列一致性分別為25.04%,26.91%和34.74%將Fem-1與分屬于雙翅目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鱗翅目等昆蟲以及人、鼠等脊椎動物的Fem-1蛋白序列進行比對,并用NJ法繪制了分子系統發育樹,利用自舉分析(Bootstrap,1000次重復)檢驗各分支的置信度。由進化樹可以發現:Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c分別與其他物種的Fem-1a,Fem-1b和Fem-1c聚到一起,形成明顯的三支。Lmfem-1a與人體虱Fem-1(GenBank登錄號:XP_002426405)的親緣關系最近,Lmfem-1b與麗蠅蛹集金小蜂Fem-1b(GenBank登錄號:NP_001153369)和赤擬谷盜Fem-1b(GenBank登錄號:XP_975561)的親緣關系最近,Lmfem-1c與赤擬谷盜Fem-1(GenBank登錄號:XM_001811644)的親緣關系最近,與同源性比對結果一致。ScanProsite功能序列分析結果表明,Lmfem-1a有6個錨蛋白重復序列模體,而Lmfem-1b和Lmfem-1c分別有8個錨蛋白重復序列模體。Lmfem-1a,Lmfem-1b和Lmfem-1c均無信號肽序列,也無跨膜結構域,屬于細胞內在蛋白質。

      作者:時紅郝友進陳斌司鳳玲王鵬何正波單位:重慶師范大學

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