免疫組織化學技術
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免疫組織化學技術范文第1篇
關鍵詞免疫組織化學女性生殖道腫瘤應用價值
陰道、外陰、宮體和宮頸等是主要的女性生殖道組成部分一般情況下這些部位所引發的腫瘤其確診是較為容易的但是由于某些腫瘤在形態學上具有相似的特征而且還有些腫瘤病變的良性和惡性難以判斷而運用免疫標記對其進行診斷可以有效的降低誤診的幾率免疫組化是一種應用免疫學的基本原理即抗原抗體反應其利用抗原與抗體相結合的特異性利用化學反應使得同位素、熒光素、金屬離子和酶等用來對抗體進行標記的顯色劑顯色從而實現對蛋白質和多肽等組織細胞的內抗原的定量、定性和定位。
資料與方法
11年7～8月對某社區1名已婚女性進行免疫組織化學檢查的資料年齡～69歲按年齡將其分為個年齡段記錄為A、B、、D四個組別其中66歲17人（9）分為D組。
方法：由婦科醫生對后穹隆或宮頸進行刮片用95乙醇固定送病理科HE常規染色操作運用巴氏V級分類法對其進行鏡檢診斷若查見癌細胞和查見可疑癌細胞的按陽性病例處理陽性病例在內膜和宮頸處取材送免疫組織化學診斷。
結果
本次進行免疫組織化學檢查的1名已婚女性中其檢出陽性的概率8有1例切片查見為疑似癌細胞經活檢證實均為良性病變其中1例判定為宮頸鱗癌9例判定為宮頸上皮非典型增生；例查見為癌細胞：其中有1例慢性宮頸炎和子宮內膜狀腺癌；1例子宮內膜增生過長和宮頸鱗癌；1例更年期子宮內膜和宮頸中度非典型增生見表1。
討論
由于免疫組織化學技術的不斷發展以及各種類型的特異性抗體逐漸顯現使得多數疑難腫瘤得以確診單純依靠HE染色對腫瘤進行病理診斷其中有5～1的病例難以依此做出肯定的形態學診斷但免疫組化在對未分化或低分化腫瘤進行鑒別和診斷時其準確率高達5～75因而免疫組織化學在女性生殖道腫瘤診斷中的應用價值受到越來越多的肯定。
外陰是Paget病常見病發部位。85的外陰Paget病屬性為原發性但也有一部分是由其他部位的惡性病變而導致在臨床治療中對外陰Paget病原發或繼發的屬性判定是十分重要的多數研究表明若外陰Paget病屬性為原發性。其細胞表達為AM5、EA和7若表達為PR、HER-、GD-P-15、ER和AR則為陰性。外陰上皮內腫瘤可分為分化型和未分化型近9的外陰上皮內腫瘤為未分化型其病變與HPV感染相關而分化型與HPV感染沒有關系后者與浸潤性鱗狀細胞癌密切相關而前者有可能是多灶性生殖道腫瘤。免疫組化p16和p5可對二者進行區分未分化型p5陰性彌漫性表達p16而分化型與之相反。
女性生殖道宮頸和大部分其他部位的腎管腺體的標記物多為D1D1在宮頸中腎管的殘留大部分表達為腔緣陽性而其他類型的良性宮頸腺體病變極少呈類似表達。但是子宮內膜腺癌和宮頸雖然表達陽性的部位非腔緣但是依舊可呈D1表達可看出官頸腺癌D1表達呈陽性的特征并不能當作為中腎管診斷的依據。inhibin、valentine、AR和calretinin等也可以作為在惡性和良性中腎管病變以及中腎管腺體中的呈不同程度表達的標記物而mace、PR和ER一般呈陰性表達。在對良性宮頸腺樣病變進行中腎管來源確診時最具價值的標記物為ER、valentine和Dl的組合在中腎管腺體中valentine和Dl呈陽性表達而ER呈陰性表達。
女性生殖道腫瘤的類型多種多樣且形態學重疊多且復雜免疫組織化學在對這些腫瘤進行鑒別診斷和診斷方面具有重要的意義但是由于免疫組織化學在外科病理診斷中只是一種輔助手段常規HE診斷在短期內依舊是無可替代的因而為了得到更準確的診斷結果在對腫瘤進行免疫標記和對免疫組化結果進行評價時一定要與組織形態學相結合。而且目前免疫組化的抗體還未找到具有絕對性的特性因此免疫標記的選用要同時包含有陰性和陽性以幫助對腫瘤進行確診。
伴隨著抗體工程技術和免疫組化技術的不斷提高應用于對女性生殖道腫瘤進行鑒別診斷和診斷的免疫標記物越來越多相關醫護人員只有不斷的加強自身的學習才能對免疫組化抗體徹底的掌握和應用才能對疾病的病理診斷做出科學合理正確的診斷。
參考文獻
1孫大治，徐云慶，史蕾，等.新型免疫標記技術研究進展及在免疫檢測中的應用[J].中國國境衛生檢疫雜志，1，（）：76-78.
免疫組織化學技術范文第2篇
【論文摘要】近年來分子生物學技術以及其它高、新技術在病理領域得到廣泛的應用，同樣作為體育界的基礎研究學科運動人體科學的發展已經不能滿足簡單的宏觀的研究，越來越多的醫學檢驗以及病理學實驗技術在運動人體科學廣泛應用，尤其是組織病理學技術中定位技術，例如免疫組化、原位雜交等。本文就以上三種病理學常用的定位技術的方法進行綜述。
1免疫組織化學實驗技術
隨著免疫組織化學染色技術的廣泛應用，病理學研究產生了劃時代的飛躍。免疫組織化學是病理學實驗中常用的方法，是在蛋白質水平用各種特異性抗體檢測細胞內各種抗原物質。根據標記物的不同，免疫組織化學技術可分為免疫熒光細胞化學技術、免疫酶細胞化學技術、免疫鐵蛋白技術、免疫金-銀細胞化學技術、親和免疫細胞化學技術、免疫電子顯微鏡技術等。
1.1免疫組織化學實驗步驟免疫組化技術是在組織化學的方法上結合免疫學的理論和技術發展起來的一門新技術。其原理是利用免疫學的核心——抗原體特異性結合的原理，用標記抗體追蹤抗原，通過化學反應使標記于結合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等顯示一定的顏色，并借助顯微鏡、熒光顯微鏡、電鏡對其顏色進行觀察，以達到檢測抗原物的目的[1]。
1.2免疫組化技術的優點免疫組化技術的優點：①特異性強，免疫組化中抗體與組織細胞中的抗原的結合是特異的。如白細胞共同抗原（LCA）顯示淋巴細胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（ABC）法和鏈酶素—過氧化物酶連接（SP）法的出現，使抗體的稀釋度(代表敏感度)達到了上千、上萬，甚至上億倍，使免疫組化技術更加可靠。③定位準確，由于抗原抗體的結合是特異的，因而免疫組化技術可在組織和細胞內準確定位，對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，將形態與功能相結合，對疾病進行深入的研究。
2原位雜交實驗技術
原位雜交是將組織化學與分子生物學技術結合來檢測合定位核酸的技術。它是用一段已知序列的核苷酸片斷來檢測細胞內是否存在欲檢測物質的DNA或RNA，是比免疫組化更加靈敏而深入一個層次的檢驗方法。根據所選探針和待測靶序列的不同，核酸原位雜交有DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交等。
2.1原位雜交技術的應用原位雜交由于不需要從待測組織中提取核酸，可完好的保存組織、細胞的形態結構，將形態學與基因功能活動的變化相結合進行多層面的研究。主要應用：①細胞特異性mRNA轉錄的定位可用于基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；②感染組織病毒DNA/RNA的檢測和定位；③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的監測；④基因在染色體上的定位；⑤檢測染色體的變化；⑥間期細胞遺傳學的研究。
2.2原位雜交技術與免疫組化的比較
2.2.1兩者的區別原位雜交與免疫組化染色技術相比較，這兩種方法的共同之處均具有定位檢測的功能，且均有較高的敏感性和特異性，所不同的是免疫組化染色是用的是抗體，其檢測對象是抗原，機制是抗原-抗體的特異性結合，是蛋白質表達水平的檢測；原位雜交使用的是探針，遵循堿基互補配對的原則與待測靶序列結合，是DNA或mRNA水平的檢測。從實驗方法來看，免疫組化染色操作相對簡單，成本相對較低，受外界因素的影響相對小；原位雜交技術無論從實驗設計上，還是從實際操作上均較免疫組化染色復雜，成本的高低與試劑的種類和來源密切相關。一般而言，直接選用商品化的標記探測和檢測試劑盒的實驗成本較高；熒光標記探針較非熒光標記探針的成本高，對樣本及實驗條件的要求較高，也更容易受到外界因素的影響。
2.2.2免疫組化與原位雜交雙標技術雙標技術是在同一張組織切片上標記兩種不同的抗體或同時應用兩種不同的檢測手段，如免疫組化和原位雜交技術，在不同層次來檢測同一細胞上某些物質的表達是否有相關性的一種實驗方法。與傳統的單項檢測相比，雙標記具有無可比擬的優越性，可以克服由于切片間各種差異而引起的時間或空間的樣本誤差。實驗方法上先進行原位雜交會減少免疫組化過程中對待測DNA或RNA的破壞或影響，一般目前均推薦先進行原位雜交后進行免疫組化標記[2，3]。具體的操作跟單純的免疫組化和原位雜交各自的方法一致。需要注意的問題就是：①所用的實驗設備必須經DEPC水浸泡或200℃烤箱過夜，操作時須帶口罩及手套；②當雜交步驟完成后，切片必須認真浸泡及長時間洗滌至少超過30min。③作免疫組化的各步驟時間均須適當延長，以增加抗原抗體間的結合，楊青春等人研究發現每個步驟均延長2～3倍時間。④免疫組化顯色后不需要用蘇木精復染，以免遮蓋核信號。
參考文獻
[1]紀小龍，施作霖.診斷免疫組織化學[M].北京：軍事醫學科學出版社，1997.5.
免疫組織化學技術范文第3篇
[關鍵詞]鼻咽癌；中期因子；免疫組織化學
[中圖分類號]R739.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1672-4208(2010)13-0011-04
中期因子(Midkine，MK)是一種新的肝素性結合生長分化因子，MK最初被描述為在胎兒與新生兒發育過程中的調節因子，后來逐漸發現MK具有與腫瘤發生有關的生物學活性，包括促細胞轉化、促有絲分裂、抗細胞凋亡、生血管作用、增強纖維蛋白溶解和趨化作用等。近年研究發現MK在從原位癌到進展期惡性腫瘤組織中均高表達，而周圍的正常組織表達量極少，顯示了其與腫瘤的發生和生長有密切關系。目前，MK在諸多腫瘤中的表達已有報道，但在鼻咽癌中的表達國內外尚未見報道。本研究旨在通過免疫組織化學方法檢測鼻咽癌組織中MK的表達情況，并進一步探討其相關臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料 隨機抽取泰安市中心醫院2006年4月～2009年6月，臨床及病理學確診的鼻咽癌病理標本44例，男性34例，女性10例，年齡22～60歲，平均年齡41歲，全部為低分化鱗癌，術前均無放射治療、化學治療及其他抗癌治療史，并參考2003版美國腫瘤聯合會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)關于鼻咽癌TNM分期方法進行臨床分期，TNN分期：T1：4例，T2：14例，r13：22例，T4：4例；N0：6例，N1：7例，N2：17例，N3：14例；M0：41例，M1：3例；臨床分期：I期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期17例，Ⅳ期14例。另選14例慢性鼻咽炎黏膜組織作對照研究。
1.2 主要試劑 兔抗人MK多克隆抗體購自武漢博士德公司，SP－9000通用型試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.3 方法 將鼻咽癌病理組織常規石蠟包埋的蠟塊作連續切片，分別作HE染色、MK免疫組織化學S－P法染色。各組織切片常規脫蠟及水化后，依次按說明書完成免疫組織化學染色各步驟，由同一技術人員使用同一批號試劑完成免疫組織化學染色。SP法免疫組織染色流程均設對照作為質量控制，用購買的MK肝癌陽性片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。
1.4 結果判斷 顯微鏡下觀察，以細胞膜和(或)細胞質中出現清晰棕黃色顆粒作為陽性判斷標準，結果以陽性細胞數所占百分比表示，即光鏡(400×)下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，陽性細胞數25％為強陽性(++)，陽性率(％)=(弱陽性例數+強陽性例數)÷總例數×100％。
1.5 統計學方法 利用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，NK與鼻咽癌臨床病理因素之間的分析采用行X列表的X2檢驗。
2 結果
2.1 免疫組織化學染色結果 MK在鼻咽癌中呈高表達，在44例鼻咽癌組織中，15例為陰性，29例為陽性，陽性表達率為65.91％，其中14例為弱陽性，15例為強陽性。在14例鼻咽炎黏膜組織中，僅有1例呈弱陽性表達，陽性表達率為7.14％，二者差異有統計學意義(P
2.2 MK表達與鼻咽癌患者臨床病理的關系MK的表達與鼻咽癌的癌組織浸潤深度有相關性，(T1+T2)與(113+T4)組間MK陽性率差異有統計學意義(P
3 討論
鼻咽癌是我國高發的惡性腫瘤之一，具有分化程度低、早期轉移率高的特點，大部分患者就診早期就有頸部淋巴結轉移，而導致預后不良，其發病機制可能與環境、病毒、遺傳等諸方面因素有關，而其生長與轉移，則與血管生成等因素密切相關。如能尋找一些能判斷其發生、發展及預后的標記物，對于診斷、治療鼻咽癌必定有積極意義。
MK是一種分泌性蛋白，可以由腫瘤細胞分泌到血清中，可以方便地通過酶聯免疫的方法進行檢測。Ikematsu等通過ELISA方法檢測到70％惡性腫瘤患者的尿液中MK水平明顯升高，認為尿中MK水平可能成為大范圍腫瘤普查的指標。筆者采用免疫組織化學染色方法，對44例鼻咽癌組織標本進行研究，其結果表明，MK在鼻咽癌中呈高表達，陽性表達率為65.91％，在14例鼻咽炎黏膜組織中，僅1例呈弱陽性表達，陽性率為7.14％，二者差別有統計學意義，這表明MK在鼻咽癌的發生發展中起到一定作用，提示MK可能成為鼻咽癌診斷的標記物之一。
免疫組織化學技術范文第4篇
【摘要】 目的： 應用組織芯片( tissue chip )-組織微陣列( tissue microarray，TMA)技術結合免疫組織化學的方法檢測肺鱗癌組織中高遷移率蛋白A1（high mobility group A1，HMGA1)的表達情況，以明確HMGA1蛋白表達與肺鱗癌發生的關系及臨床意義。方法: 用組織陣列儀制備組織芯片， 切片后采用免疫組織化學的方法檢測組織芯片上25例肺鱗癌腫瘤組織和18例對照組肺組織樣本中的HMGA1的表達情況，并分析其表達與各臨床病理學參數之間的相關性。結果: HMGA1蛋白在肺鱗癌組和對照組的陽性表達率分別為68.0 % (17/25)、16.7%(3/18) ，兩者比較差異具有顯著性(P0.05) ，而與淋巴結轉移及組織學分級有關(P
【關鍵詞】 肺腫瘤; 免疫組織化學； 組織芯片; 高遷移率蛋白A1
［Abstract］ Objective: To determine the relationship of high mobility group A1 protein (HMGA1) expression with the development of lung squamous cancer， and its clinical significance. Methods: Tissue chip/tissue microarray (TMA) technique combined with immunohistochemistry method was adopted to detect HMGA1 expression in tissue of lung squamous cancer，and the correlation between HMGA1 protein expression and lung squamous cancer. A series of tissue chips were prepared by using tissue-arrayer. Specimens from 25 cases of lung squamous cancer and 18 cases of control lung tissues were detected immunohistochemically on a tissue chip for HMGA1 protein expression and its correlation to clinic pathological paramter was analyzed statistically. Results: Positive rates of HMGA1 protein was 68.0 % ( 17 /25) and 16.7%(3/18) in lung cance and in lung tissue of control group， respectively， and the difference was significant (P
［Key words］ lung neoplasms; immunohistochemistry; tissue chip; high mobility group A1
肺癌的生長、浸潤和轉移是多種因素綜合作用的結果， 包含多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活和多種細胞因子的結構和功能的異常表達。HMGA1是一種廣泛存在于真核生物細胞中非常重要的結構轉錄因子，它在人體的胚胎發育、腫瘤形成過程中發揮著至關重要作用，近幾年研究發現，HMGA1表達與人類腫瘤的發生有關，HMGA1基因被視為癌基因［1］。2007年采用TMA技術結合免疫組織化學的方法檢測了25例肺鱗癌腫瘤組織及18例對照組肺組織中HMGA1蛋白的表達，以期驗證其在肺鱗癌組織中的表達及與肺鱗癌發生、發展的關系，探討肺鱗癌發生的分子生物學機制，為肺鱗癌診治及預后判斷標志物奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料
實驗組來自2002-2004年貴陽醫學院附屬醫院手術切除的肺鱗癌標本25例，男17例，女8例。年齡46～75歲。所有病例術前均未行放、化療。按照世界衛生組織(WHO)肺及胸膜腫瘤組織學分類，25例均為鱗癌。組織學分級(只限于鱗癌)：Ⅰ級5例，Ⅱ級9例， Ⅲ級11例。有淋巴結轉移者18例，無淋巴結轉移者7例。對照組18例，包括11例手術切除炎性假瘤病例的肺組織和3例尸檢的肺組織，以及4例肺大皰的肺組織。所有標本均經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋。
1. 2 實驗方法
1. 2.1 標本處理 取手術切除的腫瘤組織和排除肺腫瘤以外的肺組織標本各1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm，所有標本均以10%中性甲醛固定， 常規石蠟包埋。
1.2.2 組織微陣列的制作 對每一個標本蠟塊進行常規病理切片并行HE 染色，由病理科專家在顯微鏡下標記所需穿取的目的組織。利用美國Beecher組織微陣列儀(Beecher Instruments Inc)依次從受體蠟塊上穿取直徑為1.0 mm的組織芯頭，然后在供體蠟塊上根據所標記的位置準確取出所要的組織芯放入受體蠟塊的孔中，制作組織微陣列標本蠟塊。詳細記錄每個孔所放組織的編號，每個肺鱗癌和正常組織蠟塊分別選取3個點，制成陣列蠟塊，然后用切片機將此蠟塊作3 μm厚的切片，粘貼于1張由多聚賴氨酸處理過的載玻片上，制成組織芯片，60 ℃ 烤5 h，置于-20 ℃ 冰箱中保存備用。
1.2.3 檢測方法 利用免疫組織化學SABC法觀察HMGA1表達。HMGA1多克隆抗體購于美國Abcam公司，工作濃度為1∶50，SABC 試劑盒及DAB顯色液均為武漢博士德公司產品，按說明書步驟進行。切片常規化蠟下行至水，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，微波修復，5%BSA封閉液封閉，滴加一抗置于4 ℃冰箱濕盒過夜。次日取出切片，依次加入生物素標記的二抗和過氧化物酶標記的鏈酶親和素-生物素-酶復合物（Strept-Avidin-Biotin Complex，SABC），置于37 ℃水浴箱各孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復染，上行，封片觀察。
1.3 評定標準
顯微鏡下對每一個微陣列點進行觀察并評分。每個組織取3個點，計數每個點總細胞數和陽性細胞的平均數，陽性細胞率5%為陽性。HMGA1表達陽性表現為在細胞漿和(或)細胞核內著棕黃色。
1.4 統計方法
采用SPSS11.5統計軟件行χ2檢驗，臨床病理參數間的比較用Fisher確切概率法檢驗，P
2 結果
2.1 組織芯片構建圖
由圖1和圖2可見，以免疫組織化學SABC法染色后基本無掉片、移位和扭曲現象，有個別點脫落，但不影響結果的觀察。
2.2 HMGA1蛋白在肺鱗癌和對照組肺組織中的表達結果
HMGA1蛋白表達呈棕黃色顆粒，見圖3，箭頭所指處來源于圖2實驗組織芯片的一部分，主要于肺鱗癌細胞胞質，極少數在胞核表達。表1可見， HMGA1蛋白在肺鱗癌和對照組肺組織中的陽性表達率分別為68.00% ( 17 /25)、16.67(3/18)，兩組之間差異具有顯著性(P
2.3 HMGA1蛋白表達與肺鱗癌臨床病理參數之間的關系
由表2可見，HMGA1蛋白表達與肺鱗癌的淋巴結轉移、分化程度有關（P
3 討論
HMGA1是Goodwin 等［2］于1973 年在牛胸腺細胞中首次發現的，因其在聚丙烯酰胺凝膠中的高遷移率而得名的一組蛋白。HMGA1有1a和1b 2種蛋白質亞型，二者均屬于小分子染色體非組蛋白，都是由HMGA1 mRNA分子轉錄后經不同剪接而來。不同的是，在1a亞型內部存在11個氨基酸殘基。HMGA1廣泛參與細胞多種重要的核內生物學功能。在正常情況中，HMGA1在胚胎組織中高表達，在成熟組織和細胞中則不表達或表達量極低。有研究表明，HMGA1在許多人類腫瘤都高度表達［3］。在肝細胞癌及甲狀腺、前列腺、子宮頸、結腸直腸、胰腺和卵巢等腫瘤中，HMGA1的含量都顯著增加［4］。我們前期應用基因芯片技術對肺鱗癌基因表達的研究也顯示HMGA1基因表達顯著增加。為了驗證基因芯片的研究結果，采用具有高通量、節約試劑、降低實驗誤差的組織芯片技術，對對照組肺組織及肺鱗癌組織中HMGA1蛋白表達進行免疫組織化學研究，以探討HMGA1在肺鱗癌發生、發展中可能的生物學意義。結果發現，肺鱗癌組織中HMGA1蛋白的表達陽性率顯著高于正常對照組，且與肺鱗癌病人淋巴結轉移及分化程度有關，與病人性別及年齡無關。提示HMGA1蛋白可能是肺鱗癌分化及惡性程度的一個進展性指標。
有人用定量RT-PCR的研究方法表明，與對照組的肺組織相比，肺癌組織內的HMGA1a mRNA增加超過75% [5］ 。本實驗研究顯示HMGA1在正常肺組織中呈低表達， 陽性率僅為16.7 %，而在肺鱗癌組織中表達明顯增高， 陽性率高達68.0%，提示檢測HMGA1的表達有助于肺鱗癌診斷。另外，研究結果顯示，HMGA1蛋白的表達與淋巴結是否轉移和分化程度密切相關(P
參考文獻
[1] Edberg DD， Bruce JE， Siems WF， et al. In vivo posttranslational modifications of the high mobi-lity group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J]. Biochemistry， 2004(36): 11500-11515.
[2] Goodwin GH， Sanders C， Johns EW. A new group of chromatin-associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem，1973(1): 14-19.
[3] Edberg DD. In vivo posttranslational modifications of the high mobility group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J].Biochemistry，2004(36): 11500-11515.
免疫組織化學技術范文第5篇
【關鍵詞】 骨性關節炎；軟骨細胞；Caspase-3；Caspase- 12
骨性關節炎（OA）是一種累及膝關節的慢性、退行性疾病， 在我國OA患病率高達9.56%。骨性關節炎與軟骨細胞凋亡密切相關[1]， 并且Caspase-3在其中扮演著重要的角色。內質網應激（ERS）是不同于經典細胞凋亡的通路。ERS能影響軟骨細胞的分化， 抑制軟骨細胞的合成功能， 但過度的ERS使細胞表達內質網應激蛋白Caspase-12， 介導軟骨細胞凋亡。內質網應激觸發了一個包括Caspase-12， Caspase-3的特異級聯反應。其中Caspase-12為內質網應激的特異性蛋白， 而Caspase-3為所有凋亡通路的最終執行因子。
1 材料與方法
1. 1 材料 健康5月齡Wistar大鼠購自內蒙古大學動物實驗中心， 兔抗Caspase-3抗體、兔抗β-tubulin抗體購自碧云天生物技術研究所， 兔抗Caspase-12抗體購自上海生工生物工程有限公司， HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司， DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 OA動物模型制作和取材：健康級大鼠采用Hulth改良法手術橫斷前交叉韌帶行OA造模， 左側為空白對照側。另選取10只縱行剖開脛骨及股骨， 立即投入100 ml/L中爾馬林液， 固定， 脫鈣， 浸蠟， 包埋， 制備蠟塊， 供HE染色及免疫組織化學染色使用。
1. 2. 2 HE染色觀察關節病變：按常規進行HE染色， 光鏡下觀察軟骨層結構， 細胞的排列及基質染色。
1. 2. 3 免疫組織化學染色觀察Caspase-3， Caspase-12的表達 采用免疫組織化學SABC法。軟骨細胞中胞質染色成棕黃色顆粒的細胞即為陽性， 并進行平均吸光度（A）值分析， 吸光度值與陽性表達程度成反比。
1. 2. 4 Western blot法檢測Caspase-3， Caspase-12的表達 參照文獻[6]選取每例樣品， 進行分離， 濕式電轉法轉膜， 封閉等操作， 用Caspase-3、Caspase-12的A值與β-Tubulin的A值相比表示其表達的相對水平。
1. 3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P
2 結果
2. 1 關節軟骨大體形態觀察及評分 軟骨標本大體結構觀察顯示。空白對照側膝軟骨光滑呈半透明乳白色， 模型側軟骨表面粗糙、糜爛、潰瘍。
2. 2 軟骨組織的組織病理學觀察 光鏡下觀察顯示：空白對照側表層細胞較小， 其長軸平行于軟骨表面呈密集排列， 中間層細胞可見“背靠背”雙細胞分布， 深層軟骨細胞肥大呈團分布；模型側軟骨層變薄， 表層軟骨細胞稀疏甚至纖維化變性， 中間層軟骨細胞減少， 深層軟骨細胞肥大， 變成空泡狀。
2. 3 免疫組化檢測Caspase-3、Caspase-12的表達
2. 3. 1 Caspase-3在膝OA軟骨組織中的表達 空白對照側軟骨細胞Caspase-3陽性表達較少， 位于表層， 少見于中間層， 表達的A值（168.30±5.90）；模型側軟骨細胞全層均有Caspase-3較強的陽性表達， A值（99.05±7.65）， 與空白對照側比較， 差異有統計學意義（P
2. 3. 2 Caspase-12在膝OA軟骨組織的表達 空白對照側軟骨表層偶見Caspase-12陽性表達， 表達的A值（173.75±6.56）；模型側軟骨細胞表層剝脫， 中間層Caspase-12陽性表達增強， A值（115.50±6.31）；與空白對照側比較， 差異有統計學意義（P
2. 4 Western blot法檢測Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達 空白對照側、模型側軟骨細胞中Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達， 模型側表達明顯高于空白對照側， 差異有統計學意義（P
3 討論
本研究采用免疫組化及Western blot法檢測各組軟骨細胞中Caspase-3、Caspase-12的陽性表達及變化規律， 結果顯示在大鼠OA模型側關節軟骨組織中， Caspase-3、Caspase-12的陽性表達及蛋白表達均高于空白對照側， 提示在OA的軟骨組織中Caspase-3、Caspase-12均被激活， 并參與調控軟骨細胞凋亡。空白對照側中Caspase-12表達極低， 可能在沒有異常理化因素刺激的情況下， 內質網通路可能存在于正常的細胞衰老及凋亡中。Cheung等研究發現， Caspase-12缺陷小鼠對ERS誘導的細胞凋亡敏感性下降， 但對其他死亡刺激仍然敏感。證明Caspase-12是ERS激活的， 而非死亡受體或線粒體所介導的凋亡傳導信號激活的。這種凋亡信號傳導途徑最終會導致Caspase-3活化， 提示ERS最后被傳到線粒體， 線粒體有可能在這種死亡途徑中起綜合和放大的作用[2]。
綜上所述， 大鼠OA的軟骨細胞Caspase-3， Caspase-12均被激活并調控軟骨細胞凋亡；在軟骨細胞凋亡途徑中， 可能包含ERS介導的通路。
參考文獻
[1] 周景輝， 吳耀持， 李石勝， 等.鼠類膝骨關節炎模型的評價.中國組織工程研究與臨床康復， 2010， 14（33）：6206-6209.
