免疫細胞分泌

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摘要：細胞分泌活動涉及一系列復雜的分子活動和信號轉導過程,它是許多重要生命活動如神經遞質的釋放、內分泌激素分泌、蛋白質轉運等的基礎。故而有關細胞分泌活動的研究近年在國際上形成一個新的熱點。有關免疫細胞中細胞因子的分泌機制研究的較少,將膜電容測量、電化學測量、光學測量、胞內信號分子光解等近年發展起來的生物物理方法引入免疫學領域,對研究免疫細胞的分泌調控和信號轉導意義重大。細胞分泌活動是生物體信息傳遞和細胞功能的基本過程之一,如神經系統中神經遞質和激素的分泌、免疫系統中細胞因子和抗體的分泌等。細胞分泌活動涉及一系列復雜的分子活動和信號轉導過程,隨著新技術尤其是細胞分泌檢測技術的不斷出現,這一過程正在被逐步揭示出來。目前對神經遞質釋放的研究已經很深入,而對免疫細胞分泌活動尤其是細胞因子分泌的動力學和分泌調控機制的研究則相對較少。將膜電容測量、電化學測量、光學測量、細胞內信號分子光解等生物物理方法引入免疫學領域,可能為免疫細胞分泌的調控和信號轉導研究提供大量有意義的數據,從而盡快填補該領域的研究空白。

1單細胞分泌實時測量的新方法

細胞分泌活動的傳統研究方法主要采用ELISA、RIA、FACS等階段性定量測定或冰凍蝕刻電鏡技術、普通光學顯微鏡技術等形態學研究方法,都屬于非現場靜態研究,并且是大量細胞共同3期婁雪林等:免疫細胞分泌研究進展生理學報ActaPhysiol.Sin.54卷測定。近年來,各種實時監測技術的發展極大地促進了人們對細胞分泌機制的了解。下面就目前常用的三種細胞分泌實時檢測技術的原理、方法以及優缺點作簡要介紹。

1.1膜電容測量

近10年來,膜電容檢測技術在研究細胞胞吐和胞飲機制方面得到了越來越廣泛的應用［1］。細胞分泌的最后一步是囊泡膜與胞漿膜融合的過程,當分泌發生時細胞膜的表面積會增加,而細胞膜的電容大小正比于細胞膜的表面積(～1μF/cm2),因此細胞膜電容的增加就代表細胞分泌量。這種技術對囊泡分泌的時間分辨率極高(～ms),常用來研究分泌事件與離子通道活動以及細胞內第二信使的關系。最近出現的細胞貼附膜片電容技術,膜電容分辨率可達到0.1fF,能檢測到直徑60nm的小囊泡分泌［2］。這一方法為研究單個小囊泡的分泌活動如膜融合孔開閉動力學、膜融合事件的分子調控等提供了強有力的工具。由于胞吐后囊泡膜的回收會導致膜電容的減少,因此膜電容檢測技術也能提供囊泡胞飲過程的信息。

膜電容測量技術可用于神經細胞、內分泌細胞、免疫細胞等大多數細胞的分泌測量,而且測量精度和時間分辨率都較高,但該方法不能排除胞吞對胞吐檢測的影響,并且對試驗條件如封接電阻(Rm)、串聯電阻(Rs)的要求很高,對于一些較復雜結構如神經軸突終末、與周邊細胞有電學偶聯的細胞等則不能用該技術進行研究。

1.2電化學測量

用電化學技術監測細胞分泌的原理是:在電極尖端表面施加一定的電壓,容易氧化的化學信使物質就會在電極尖端釋放出電子而發生氧化,電極可獲得電子并產生一定的電流［3］。微電極的電流大小與電極尖端面積和實驗類型有關,一般在pA到nA范圍,通常采用膜片鉗放大器等低噪聲儀器進行檢測。對單個分泌電流峰積分即可估算出每個囊泡中包含的遞質分子數,即量子包裝的大小。施加的電壓可為恒電位或三角波循環電壓,前者的優點是時間分辨率高,后者的優點是能區分不同的信息分子。在單細胞胞吐測量時兩種方法可以互相補充。目前兒茶酚胺、5-HT、胰島素、組胺、nO以及含色氨酸或酪氨酸殘基的多肽激素或遞質都可直接或間接地使用該方法檢測［16］。

電化學技術監測分泌的最大優點是時間分辨率高(ms級),能監測單個囊泡的釋放以及囊泡中的遞質含量,且較膜電容測量更為直觀;其次具有一定的細胞空間分辨率,可用于測定細胞釋放熱區(hotspot);另外,該方法對細胞無損傷,可進行長時間監測。但是電極只能檢測到少部分信息物質(10％左右),而且對于那些不能被氧化的物質的釋放不能直接檢測［16］。本方法常與膜電容方法聯合應用來研究分泌事件,以相互補充。

1.3細胞分泌的光學測量

用普通光學顯微鏡只能檢測巨大囊泡的分泌過程,而新的熒光染料的開發和顯微成像技術的發展使實時監測小囊泡的分泌成為可能［4］。FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活動的選擇性膜表面熒光標記物,它們在水相中沒有熒光,當它們插入脂質膜后則顯示較強的熒光,囊泡膜胞吐后會使細胞表面熒光增加,而胞吞回收的囊泡因吞進細胞周圍的染料而被熒光標記,這樣便能夠實時觀察細胞的胞吐及胞吞過程。本方法的缺點是背景熒光較大,fM染料目前尚不能用于腦片等組織切片的分泌研究。另一種方法是通過基因轉染方法將熒光基因如綠色熒光蛋白(GFP)基因轉入靶細胞中并選擇性地在囊泡中表達,然后用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡等檢測囊泡的運動過程［5］。例如,將GFP基因與囊泡特異的前胰島素基因整合后轉入胰島INS-1β-細胞中進行表達,然后用熒光成像技術實時研究活分泌囊泡的轉移、錨定和胞吐過程。此外還有免疫熒光標記法:多巴胺β羥化酶(DBH)在嗜鉻細胞分泌囊泡中是一種主要的膜蛋白,由于它在胞吐中會出現在細胞膜的表面,隨著它與胞外液中熒光標記的DBH抗體的結合,就能觀察到胞吐位點在細胞膜上的分布以及囊泡膜的回收過程。1.4胞內信號分子光解方法

細胞分泌活動受很多因素的調控,采用信使物質瞬時釋放的方法［6］,可以定量研究各因素對分泌的影響。神經遞質的分泌與細胞鈣離子濃度緊密偶聯(與鈣離子濃度的3～4次方成正相關)。Ca2＋螯合物DM-nitrophen和NitrophenyleGTA可用于快速而均勻地提升細胞內鈣離子濃度,將這些物質與Ca2+染料通過膜片鉗電極或孵育的方法導入細胞內,然后經高能量的紫外光激發,便能產生一個迅速的、階躍性的鈣升高,并且整個細胞鈣濃度都會均一地升高。這克服了單純電刺激引起的離子通道附近產生不同的鈣微區的缺點。DM-nitrophen在光解前對Ca2+有很高的親和力,對靜息的細胞鈣緩沖幾乎沒有影響,是研究細胞鈣緩沖和鈣穩態系統的非常理想的材料。通過控制激發紫外光的強度,可以用來進行細胞內鈣離子濃度滴定,也可用于鈣結合力測定以及其他許多鈣依賴的細胞功能活動。但是它易受Mg2+結合的影響。而NitrophenylEGTA對Ca2+有更高的選擇性,但它在光解前對Ca2+親和力較低,且不易被光解產生大的Ca2+階躍。除了Ca2+外,許多第二信使如cAMP等都可用該方法對其細胞內濃度進行精確控制。

2免疫細胞分泌的細胞和分子機制

2.1免疫細胞的離子通道和細胞功能

免疫細胞不屬于可興奮性細胞(如神經細胞、肌肉細胞等)之列,但也具有某些與神經細胞相類似的電生理特性。離子通道的活動與離子跨膜流動、膜電位的變化以及隨后的淋巴細胞激活密切相關。在大多數淋巴細胞上存在有不同的離子通道,這些離子通道類似于神經細胞以及肌肉細胞的離子通道,但又有其自身的特點。Na通道僅存在于少數T細胞、T細胞株和自然殺傷細胞。電壓依賴性K通道存在于大多數T淋巴細胞、T淋巴細胞株和巨噬細胞［7］,類似于神經細胞上的延遲整流K通道特性。根據其電壓激活和滅活的動力學特性以及藥理學特征可分為3種亞型,它們隨細胞的發育狀態和功能分類不同而有所變化,可能與細胞有絲分裂有關。絲裂酶原刺激后24h可使K電流增大;K通道阻斷劑則能劑量依賴性地抑制有絲分裂和抗原引發的淋巴細胞的激活,可能是“K通道開放-細胞膜去極化-Ca2+通道開放”通路被抑制后細胞外Ca2+內流減少所致［8］。Ca2+激活的K通道K(Ca)則由絲裂酶原引起的細胞Ca2+濃度升高激活,進而引發K外流和細胞膜的超極化。電壓依賴性Ca通道僅在B淋巴細胞上存在,而在T淋巴細胞以及T淋巴細胞株均未見報道;但T淋巴細胞上存在一種非電壓依賴性的Ca2+通道,由T細胞抗原所激活,然后通過第二信使IP3,引發細胞內Ca2+庫釋放,增強Ca2+離子跨膜內流或Ca2+依賴性滅活。

目前,Ca2+作為細胞內較早激活的一個重要的第二信使已被接受,但其后續信號過程尚不清楚。T細胞的Ca2+信號可分成兩相:快速的Ca2+峰和隨后的Ca2+平臺,前者由細胞內鈣庫的釋放引起,后者則由CRAC引發的持續跨膜Ca2+內流引起。單細胞上的鈣信號可表現為反復的鈣振蕩,這可能是一種通過頻率編碼來傳遞信息的方式。鈣信號的頻率特性可通過幾種非線性反饋系統來調控,如PKC介導的CD3γ亞基的磷酸化負反饋(可反饋抑制TCR/CD3的功能)、ca2+信號放大正反饋(內質網Ca2+的釋放和同時發生的CRAC以及PLC的進一步激活)、ca2+離子的自身負反饋。關于G蛋白是否介導“TCR/CD3-PI水解-Ca2+動員”信號通路,尚是一個懸而未決的問題,一些間接證據表明T細胞的激活需要G蛋白的參與,TCR/CD3可能在結構上形成G蛋白偶聯受體［9］。聯合應用膜片鉗技術、單細胞熒光測量以及報告基因(如GFP、rFP)等研究方法,有望闡明免疫細胞的信號轉導、淋巴因子的分泌機制和其他相關的細胞功能。

2.2免疫細胞分泌抗體或細胞因子的研究

經過適當處理,免疫細胞可應用膜片鉗測量細胞膜電容。膜電容正比于細胞膜表面積。當分泌小泡與細胞膜溶合并胞吐時,便伴有膜電容的增加。人的中性粒白細胞是成功應用whole-cell和on-cell膜片鉗法進行研究的少數免疫細胞之一［10］。通過膜片鉗電極向細胞內導入GTPγS,可引起膜電容從靜息時的3pF增加到8～9pF。有趣的是雖然GTPγS導入可引起暫時的Ca2+濃度升高和膜電容的增加,但當加入高濃度的Ca2+緩沖物質將鈣升高阻斷后,膜電容的升高依然存在而不受Ca2+離子的影響,表明GTPγS引起的分泌不需要Ca2+離子的參與,屬于Ca2+非依賴性分泌,這與經典的Ca2+依賴性分泌明顯不同。進一步研究Ca2+和GTPγS的促分泌效率的差別和他們分別在什么情況下起作用將是一個重要課題。當向細胞導入高濃度Ca2+時,分泌過程呈現2種不同的動力學成分,第一相只需要1～10μmol/L的Ca2+,而第二相則需要100～300μmol/L的Ca2+濃度,他們分別對應免疫細胞內不同性質的囊泡,即不同的Ca2+濃度控制不同的囊泡分泌,以適應不同的細胞功能。

lollike等［2］應用細胞貼附式膜片鉗技術在中性粒白細胞研究了免疫細胞脫顆粒的動力學,包括單個囊泡融合的動力學特性,用這種方法,他們可以分辨出1fF的階梯狀電容變化(對應單個囊泡分泌事件)。在形成封接后,他觀察到一種自發的階梯狀膜電容降低,代表直徑60～165nm的囊泡小泡的內吞。當用Ionomycin刺激后,可觀察到0.1~5fF大小不等的階梯狀電容升高,代表了白細胞不同類型囊泡的分泌(圖2)。對于直徑＞180nm的囊泡可以直接觀察到單個融合孔活動,融合孔起始平均電導為150pS,最小的僅有35pS,隨后融合孔逐漸擴大,擴展速度有快有慢,與報道的巨大的囊泡融合孔特性類似。這是首次直接觀察到直徑＜500nm的小囊泡的融合孔,根據其起始電導小的特征,可以推測融合孔的形成必須有蛋白質參與。免疫細胞融合孔也存在閃爍開閉(flicker)的現象［11,12］,這表明小囊泡的胞吐是可逆的。在融合孔閃爍過程中,其電導通常＜1ns,并且在開和關兩種狀態的大小是一致的,這表明中性粒細胞的融合孔在低電導時不存在細胞膜脂質的流動;這與肥大細胞上的研究結果不同,后者閃爍更快［13］,融合孔打開值較關閉時的值小,存在細胞膜脂質不斷轉移到囊泡的現象［14］。Lollike還發現一種假閃爍(pseudoflikers)現象:單個囊泡融合后會觀察到一種漸進性的膜電容下降,其原因尚不清楚,可能是幾個直徑＜60nm的小囊泡的快速融合的結果,也可能是電極內的小部分膜片逐漸貼到電極壁上所致。關于膜融合孔調控的分子機制研究還剛剛起步。馬的嗜酸性白細胞含有巨大囊泡,它的融合孔的擴大可由Ca2+和PKC通過不同的機制進行調節［15］;粒細胞的融合孔似乎在開放狀態下也受到蛋白質的調控,而中性粒細胞的融合孔的調控機制尚是空白。與融合孔的研究相比,對膜分裂孔(fissionpore)的研究非常有限,因為胞飲囊泡通常非常小,不能被全細胞膜電容記錄所分辨,而細胞貼附式膜電容記錄可分辨出單個囊泡的胞飲,Lollike已經分辨出直徑300～700nm的小囊泡分裂孔［2］。該研究的進一步深入,有望揭開囊泡融合晚期分子活動的神秘面紗,這不但對細胞免疫學而且對神經科學和內分泌學都意義深遠。

受whole-cell技術約束,許多免疫細胞還不易用膜電容記錄。但較新的微碳纖電極(CFE)技術可能彌補此缺。這種電化學方法靈敏度極高,可檢測到單個小泡分泌［16］。

2.3免疫細胞分泌功能的調控

免疫系統是生物體的防御系統,免疫細胞抗體和細胞因子的分泌受到細胞內信號分子和細胞周圍微環境的精確調控。對肥大細胞的研究表明,PKC活性是調控肥大細胞脫顆粒的重要因素［17］。肥大細胞激活后,細胞內多個信號轉導通路被激活,導致炎癥前細胞因子立即釋放和其他細胞因子的延遲性釋放。這一過程除需要激活酪氨酸激酶(tyrosinekinase)外,還需要PKC的激活來使絲氨酸和蘇氨酸磷酸化。對于PKCβ缺陷的小鼠,IL-6的分泌反應消失或減弱,而IL-3引發的肥大細胞增值反應和凋亡率不受影響。Cho等［18］用BLT酯酶分析(BLTesteraseassay)在NK細胞的研究表明:細胞粘附分子ICAM-1能夠抑制IL-12引發的NK細胞的脫顆粒和細胞毒性作用,人ICAM-1抗體R6.5mAb能阻斷這一作用;fluo-3AM熒光測量的結果表明上述過程為Ca2＋依賴性分泌,ICAM-1能抑制NK細胞的Ca2＋離子內流。MHC-I類抗原NK細胞受體可抑制NK細胞的脫顆粒和自然殺傷作用,但是尚不清楚是哪種特異性受體介導了這種作用,以及這些受體是否影響細胞因子分泌等NK細胞的其他功能。最近的一項研究［19］表明,Ly-49A受體能調控NK細胞的囊泡胞吐和細胞因子的分泌,在NK細胞介導的細胞毒性作用過程中，作為MHC-I分子的一個抑制性受體而存在,而且僅通過由Ly-49A介導的信號轉導過程就足以產生抑制效應。

90年代分泌機制的研究獲得了突破性的進展,發現細胞分泌的關鍵蛋白質復合體SNARE是導致包括神經元、內分泌細胞和免疫細胞在內的各種細胞分泌發生的共同分子機制［20］。

在可興奮性的神經和內分泌細胞上,分泌活動對Ca2+濃度呈3～4次方的依賴性,因此稍微提高膜融合分子與Ca2+的親和力即有可能觸發分泌。細胞可能通過不同種類囊泡的空間定位差異來實現特異的調控,也可能通過囊泡對鈣離子的敏感性或其分泌動力學特性的不同來調控不同分泌活動。小囊泡由于其Ca2+閾值高和分泌速率快,瞬間升高的Ca2+信號更能有效地觸發其分泌;而大囊泡的分泌則更依賴于緩慢的幅值較低的Ca2+信號。區分不同囊泡動力學特性和Ca2+依賴性有助于了解不同分泌囊泡的分泌調控機制。當然細胞也可能通過不依賴Ca2+信號的其它信號系統來直接調控不同的分泌,例如PKC的激活可觸發分泌［21］,g-蛋白偶聯的受體latrophilin也可在無明顯Ca2+信號升高的情況下觸發分泌［22］。許多免疫細胞如T細胞、B細胞、肥大細胞、巨噬細胞等受到刺激后可以立即脫顆粒,釋放其炎癥因子, 這一過程涉及的分子眾多,其分泌調控的復雜性不亞于神經細胞。

最近,Paumet等［23］在RBL-2H3肥大細胞株上對細胞胞吐的SNARE分子機制進行了研究,發現了幾種SNARE蛋白質復合體的異構體表達,其中一種23kDa的SNAP(SNAP-23)對SNARE的形成非常重要。在syntaxin家族中,syntaxin4能夠與SNAP-23以及其他的VAMP蛋白質分子,但不能與破傷風毒素不敏感的VAMP(TI-VAMP)結合。Syntaxin4的高表達能抑制FcepsilonRI依賴的的分泌活動,而syntaxin2和syntaxin3均無此作用。細胞內膜結構上存在4種VAMP蛋白:VAMP2、cellubrevin、tI-VAMP和VAMP8,其中以VAMP8對細胞胞吐活動最為重要。這一研究首次表明,非神經元性的VAMP8異構體(最早在早期內體上發現)參與分泌囊泡的調控。

chen等［24］對血小板分泌的分子機制進行了研究,揭示了SNAP-23在Ca2+引發的致密顆粒釋放中的作用。血小板含有幾種t-SNAREs,如syntaxin2、syntaxin4、syntaxin7以及SNAP-23等,Ca2+引發的分泌可以被重組的α-SNAP加強而被抗NSF抗體所抑制;sNAP-23抗體或者抑制性C末端SNAP-23肽(inhibitoryC-terminalSNAP-23peptide)都可以致密顆粒的胞吐。在抗syntaxin抗體中,只有syntaxin2抗體可以抑制致密囊泡的釋放,免疫沉淀印跡的結果證明在體內2個syntaxin2和SNAP-23結合形成一個復合體。上述結果表明,sNAP、NSF以及特異性t-SNARE都參與了致密囊泡脫顆粒過程。

3免疫細胞的分泌活動和免疫-神經-內分泌網絡

免疫系統、神經系統以及內分泌系統之間的關系非常密切,呈現一種復雜的相互影響的調節網絡:即“神經-免疫-內分泌網絡”,其中主要由激素、神經遞質、細胞因子三種物質來傳遞信息,而這些信息分子的分泌是三者相互聯系的一個基本環節。

免疫系統的穩定最終可歸結為免疫因子分泌的平衡。免疫細胞的分泌活動除了受自身的調控外,還受神經和內分泌系統的調節。形態學研究表明,在幾乎所有免疫細胞上都有不同神經遞質和激素的受體,同時許多種神經遞質和激素受體在免疫細胞上都有分布。功能研究表明,很多激素和神經遞質具有免疫調節功能。例如,腎上腺皮質激素就是最早發現的具有免疫調節功能的一種激素,它對淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞都有抑制作用。而生長激素(GH)對幾乎所有免疫細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞、胸腺細胞等都有促進分化和加強功能的作用。另一方面,免疫系統可以影響神經和內分泌系統。免疫細胞可以分泌多種細胞因子如淋巴因子和單核因子等,而在神經和內分泌細胞上有相應的受體接收免疫系統的信息。

細胞因子和神經遞質以及激素的多功能位點特性是其神經和免疫調節的分子基礎。基因點突變的研究表明:IL-2分子具有相互獨立的免疫功能位點和鎮痛功能位點,而作為神經遞質的內啡肽也有相互獨立的鎮痛和免疫調節結構域。除此之外,許多細胞因子和遞質都有多功能位點特征。另一方面,細胞因子除了具有多功能位點特性外,還具有多受體介導機制,即同一種細胞因子可作用于不同的受體而起到神經調節或免疫調節的作用,如IL-2的中樞和外周鎮痛作用可以被納洛酮阻斷,而其增值CTLL-2細胞的作用卻不受影響。

細胞因子的分泌作為免疫系統信息調控的上游過程,便成了“神經-免疫-內分泌網絡”的一個基本而重要的環節,免疫細胞活性物質的分泌不但受到免疫系統自身的精確調控,而且受到神經系統和內分泌系統的嚴格調節,其中涉及的細胞和分子機制十分復雜,相關的研究也處于探索階段。

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