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【關鍵詞】 槲寄生生物堿;P53;RT-PCR;人肝癌細胞株SMMC-7721
Abstract Objective:To examine the effects of mistletoe alkali on P53 expression in Human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Methods:MTT assay was used to evaluate the inhibitory effects of mistletoe alkali on the proliferation of human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. RT-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique was used to evaluate P53 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721. Results:Mistletoe alkali significantly inhibits the growth of SMMC-7721 cells in a time and dose-dependent manner. After exposure of SMMC-7721 cells with mistletoe alkali at 0.100mg/mL for 24 hours, the relative intensity of P53 mRNA expression level as determined by RT-PCR increases markedly (P<0.01). Conclusion:The stimulation of the expression of anti-oncogene P53 by mistletoe alkali may underlie the molecular basis for it to inhibit tumor growth
Key words Mistletoe alkali; P53; RT-PCR; Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721
原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居惡性腫瘤的第二位[1],且原發性肝癌具有起病隱匿、進展迅速、高度惡性、易轉移復發、治療難度大、生存期短等特點,被稱為“癌中之王”[2]。目前肝癌以外科手術為首選治療方案,但術后5年生存率并不理想,總體只有62.9%,大肝癌術后5年生存率僅34.6%。近年來應用傳統的中藥治療日益受到重視。槲寄生為桑寄生科植物槲寄生[Viscum coloratum(Komar)Nakai]的干燥帶葉莖枝,其味苦、平,歸肝、腎經,有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎作用[3] ,且槲寄生有較好的抗腫瘤效果[4] 。本文從分子水平探討槲寄生抑制肝癌的機制。
1 材料與方法
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1.1 材料
1.1.1 細胞株 人肝癌細胞SMMC-7721,購于中國科學院上海細胞研究所。
1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青公司),二甲基亞砜、MTT(Amersco),RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(寶生物公司),瓊脂糖(Promega),引物(上海生工)、Forma CO2培養箱(美國),ELX-800酶標儀(美國),Enpddorf低溫離心機(德國),PCR儀(美國),紫外分光光度計(日立),倒置顯微鏡、凝膠成像系統(上海康樂)。
1.1.3 藥物 槲寄生購于包頭益仁堂中藥房,山西醫科大學藥學系揚官娥教授鑒定該中藥為槲寄生并非其他寄生。槲寄生生物堿由本?;瘜W教研室予以提取。將提取物以碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑檢驗呈陽性反應,證明提取物為槲寄生生物堿。
1.2 方法
1.2.1 體外細胞培養 細胞培養于含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養基中, 37℃、5%CO2培養箱中培養,每2天換液1次。
1.2.2 MTT法測定槲寄生生物堿對肝癌細胞增殖的影響 取對數生長期的肝癌細胞調整至1×105/mL,取0.200mL接種于96孔板,置37 ℃、5%CO2培養24h后棄原培養液,加入濃度為0.200mg/mL、0.100mg/mL、0.050mg/mL、0.025mg/mL槲寄生堿培養液各0.200mL,每個濃度設6個復孔,分5次重復,并設陰性對照、5-Fu陽性對照(10μg/mL)和空白對照孔,同時作3個板。分別作用 24h、48h、72h后傾去上清液,用D-Hanks洗滌2次,各孔加入5%MTT 0.020mL,37℃4h后吸去上清液,加入DMSO 0.150mL,振蕩10min使結晶充分溶解后上酶標儀490nm處測吸光度A值。抑制率(%)=(對照孔A值-實驗組A值)/對照孔A值×100 %。依據MTT結果用改良寇氏法計算IC50。
1.2.3 槲寄生生物堿對人肝癌細胞SMMC-7721P53 mRNA表達影響的測定 (1)細胞給藥:取對數生長期的SMMC- 7721細胞調整至2×105/ mL,2.500mL接種于6孔板,置37℃、5 %CO2培養箱,培養24h后棄原培養液,對照組加入不含藥物的培養基2.500mL,試驗組依據MTT結果加入含濃度為0.100mg/mL槲寄生生物堿培養液2.500mL培養24h(抑制率為38%)。(2)總RNA的提?。河肦NAiso Reagent提取試劑,經氯仿抽提、異丙醇沉淀,分別提取實驗組和對照組細胞總RNA。提取的總RNA用紫外分光光度計在260nm和280nm下檢測其吸光度值,以A260nm/A280nm比值表示其純度。(3)引物設計:參考文獻[5-6] 及GenBank中基因序列設計引物。P53上游引物:5′-TGTCCCCGGACGATATTGAAC-3′,下游引物:5′ -TTCCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′;β-actin上游引物:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,下游引物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。(4)RT-PCR反應:逆轉錄取總RNA 1μL按反轉錄試劑盒要求配成10μL反應體系,實驗組和對照組分別進行逆轉錄PCR反應。轉錄條件為30℃ 10min、50℃ 20min、99℃ 5min、5℃ 5min,共一個循環。(5)PCR反應:β-actin擴增條件: 94℃預變性2min,94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,35個循環,72℃延伸8min。P53擴增條件:94℃預變性2min,94℃30s,56℃30s,72℃1min,35個循環,72℃延伸8min。
1.2.4 半定量分析 將擴增的RT-PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳45min。電泳結束后在紫外透射儀下觀察電泳條帶,于凝膠成相儀上進行目的條帶的密度定量,以目的基因條帶的密度與內參β- actin的密度之比作為該目的基因的mRNA的相對含量。
1.2.5 統計學處理 實驗結果用SPSS 11.5統計分析軟件處理,數據用x±s表示,行t檢驗,以P<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果在哪
2.1 槲寄生生物堿對細胞增殖的影響 槲寄生生物堿對SMMC-7721細胞有顯著生長抑制作用,且呈劑量和時間依賴方式,0.100mg/mL和0.200mg/mL濃度組在24h、 48h、72h均表現出抑制SMMC-7721細胞生長作用,抑制率分別為38%、52%、75%和52%、74%、93%,且作用強于5-Fu。 0.050mg/mL組及0.025mg/mL組也表現出抑制SMMC-7721細胞生長作用,在3個時間點抑制率分別為9%、21%、49%和0%、5 %、23%,但作用弱于5-Fu。
2.2 RT-PCR結果
2.2.1 總RNA抽提結果 所提取RNA經紫外分光光度計檢測A260nm/A280nm比值為1.8,說明提取的樣品為較純的RNA。
2.2.2 槲寄生生物堿對人肝癌細胞SMMC-7721 P53 mRNA表達的影響 0.100mg/mL槲寄生生物堿作用24h后能增強人肝癌細胞SMMC-7721 P53 mRNA表達,差異有統計學意義(P<0.01)。電泳及P53 mRNA/β-actin mRNA半定量見圖1及表1。
圖1 槲寄生堿對肝癌SMMC-7721細胞P53 mRNA表達的影響(略)
M為Marker,1、3為對照組,2、4為藥物組,1、2為P53,3、4為β-actin內對照
表1 槲寄生堿對肝癌SMMC-7721細胞P53 mRNA表達的影響(略)
*與對照組比較P<0.01
3 討論在哪
槲寄生是我國傳統中藥,分布廣泛,在我國主要分布在東北、華北地區,資源豐富。為了開發利用天然資源,國內外的學者作了大量的工作。目前證實槲寄生有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調節、抗氧化、抗衰老等作用。目前研究較多的是槲寄生苷類的結構及槲寄生毒肽的抗腫瘤作用,對生物堿的研究不多。彭海燕等[7]的研究表明槲寄生生物堿在120mg/kg計量時對小鼠肝癌H22 的抑瘤率可達73.8%。腫瘤抑制基因是腫瘤遺傳學及分子生物學的研究熱點。P53基因與腫瘤關系最為密切。野生型的P53基因產物監控基因組的完整性,當DNA受到損傷時,野生型P53產物通過轉譯后的穩定作用,蓄積、促進細胞周期停留在G1期,用這額外的時間進行修復[8]。野生型P53基因的結構和表達異常是肝癌中最多的基因改變之一[9]。
本實驗從分子水平探討槲寄生生物堿的作用機理與基因表達的關系。我們選擇了與腫瘤發生關系密切的基因P53作為研究對象,檢測其mRNA的表達。研究發現,槲寄生生物堿0.100mg/mL作用于肝癌細胞株SMMC-7721 24h后,野生型P53表達增強。這表明槲寄生生物堿可能激活抑癌基因P53而使癌細胞死亡從而發揮其抗腫瘤作用。對于槲寄生生物堿作用后其他濃度及時間點基因表達的改變有待繼續研究。
【參考文獻】
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[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學工業出版社,2005:258.
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[8] Vaziri H,Benchimol S.From telomere loss to p53 induction and activation of a DNA-damage pathway at senescence: the telomere loss/DNA damage model of cell aging[J].Exp Gerontol,1996,31(1-2) :295-301.
關鍵詞:美術 課堂 觀察 生活
教師應當加強美術與其他學科的聯系,與學生生活經驗緊密聯系在一起,使學生在實際生活中領悟美術的獨特價值,從學以致用的角度激發學生的學習動力,促使學生努力追求生活的藝術。那么,如何使小學美術教學走向生活化呢?
一、 引導學生觀察生活,體驗生活。
如蘇教版小學美術《亮眼睛》這一課屬于觀察技法課,孩子對人的眼睛很熟悉,但平時卻沒有意識、積極地去表現和了解。在本課的學習中教師要讓學生自己收集有關資料,體會美術和生活的滲透關系,并且通過欣賞、觀看、討論交流、表演體會感受眼睛所表達出的人的精神內涵和保護眼睛的意義。為此,我在本課的教學環節中多次加入觀察環節,如:
一、 創設情境 引起關注
1、小游戲:猜猜看(課件播放圖片)讓孩子通過觀察,感受從他們的眼中猜到他們看到了什么。孩子看圖片討論。
(設計意圖:與孩子的實際聯系交流自己的所見、在小游戲中猜猜他人眼中的事物,可以進一步提高大家的學習情趣,更為在表現階段畫眼中的事物打下基礎。)
二、觀察發現,引導想象
1 請孩子們互相觀察一下周圍同學的眼睛,再來說說自己都看見了什么。
2 教師引導學生發現眼睛各方面的細節,如輪廓,高光等。
(設計意圖:學生互相有目的地觀察眼睛,有目的的感受眼睛的自然形態,為表現亮眼睛的形狀、色彩、特征和神態做準備。)
3、 學生觀看課件,了解眼睛的結構與簡單的視物原理。
(設計意圖:利用卡通動畫形象介紹眼睛的知識,生動形象,易于接受,讓學生能夠很生動的了解到眼睛視物的原理)
4、小游戲:請大家觀察一下屏幕上的幾雙眼睛,猜猜他們分別是什么人的眼睛?能說出原因嗎?
(設計意圖:學生初步體會眼睛的神態,讓學生通過選擇游戲比較了解不同年齡、不同性別人的眼睛的不同特點。)
三、觀察交流、表達審美感受
學生以小組為單位表演互相作出不同的表情,其他學生觀察眼神與眼形的變化。
(設計意圖:藝術是相同的,讓學生在歌曲中感悟人類心靈的窗口,學生在自己的眼神的表演中加深對眼神的理解。)
二 創設生活化的情境,激發興趣。
生活化情境教學是一種教學方法,就是教師在美術課上根據教學目標,利用各種教學手段,創設一種符合學生心理年齡特點的環境和條件,使學生自覺地全身心地投入到美術活動中來,從而激發學生的學習興趣。
如在上《亮眼睛》課件播放“山區學生” 照片,通過觀察山區孩子的眼睛,讓孩子談談自己的感受,教師引導學生聯想:“他們渴望什么?” 學生體會渴望讀書的眼睛。
教師引導學生關心窮苦的孩子,珍惜自己的美好生活。
三 及時即興創作,表現生活
孩子的感受源于對生活的體驗,是他們心靈的反映,作為美術教師,我們認為應該及時、正確地引導和激勵學生樂于動筆、勤于動筆,及時創作,表現生活。如:
1教師示范
學生觀看教師表現的過程,想象與教師交流眼中看到的內容。
(設計意圖:此環節體現了美術課中教師的示范性,學生從中體會刻畫的過程,知道刻畫的重點,這是解決重點的必要環節。)
2、學生創作、繪畫
1、可以畫自己的眼睛,也可以話別人的眼睛。比比誰觀察的最仔細,誰畫的眼睛亮! 學生選擇自己喜歡的美術工具和方法,畫一幅“亮眼睛” ,表現出眼睛的形狀、顏色、神態等。
四 巧妙運用美術,美化生活。
將美術應于生活是美術教育的最終目的。學以致用,讓學生獲得創造的滿足感與成就感。教學中教師可以根據學校的活動,為學生創設運用美術的生活環境。如:
1、教師:眼睛對我們這么重要,我們要不要保護他們呀?那怎樣保護呢?
學生討論自己怎樣保護眼睛。
2、教師:同學們,每年的6月6日是全國的愛眼日。每年愛眼日的主題。
學生說說自己對愛眼日的了解
有一雙辨別七彩的銳眼,借助不同色彩所傳達的情感,而很好的抒發自己的感情,不免有事倍功半的效果。用心愛惜自己的眼睛,愛惜這一心靈的窗戶,不讓其受一丁點的傷害。設想,倘若眼睛失去觀看色彩的能力 ,又何以能想象出百花的嬌艷、寶石的璀璨和鳳凰的色彩斑斕……
眼睛是心靈的使者,通過從眼睛中“放射 ”出的光澤,傳遞著人的思緒,也傳達著人的情感。溫情脈脈的人,總流露出柔和的目光,使人神魂顛倒;兇神惡煞的人,總發射出兇惡的“利箭”,讓人毛骨悚然。沒有感情的人眼眸黯淡無光,失去光明的人的眸子無法表達他的心緒,因此人們不理解他的心事,漸漸地變得郁郁寡歡,對生活抱怨,對人冷漠,封閉自己。他的生活從此失去色彩,他的生活從此失去意義。
何不讓眼睛成為情感的代言人,讓它更好地傳遞你的千恩萬緒,那就必須細心的呵護它,千萬不可小視對它的保護,它才能真正為你效勞,將你交予它的任務完美的表現出來。
世間萬物只有通過眼睛看才能將其美與獨特顯示得恰到好處。“春游芳草地,更賞綠荷池。秋飲黃花酒,冬吟白雪詩?!倍嗝赖募竟濏嵚桑瑳]有眼睛的洞察,能品味到嗎?
保護眼睛,它是人類擁有最寶貴的財富,用心地去呵護它,不一定要有最好的待遇。眼睛從不攀比,它從不在乎別人對它的付出是否超眾,只要有用它就欣然接受。只要你有心并用心去愛護,做好眼保健操,就是對眼睛最好的保護。
有時,偶爾的一個眼神,已勝過千言萬語。
我相信眼睛是心靈的使者,因為眼睛在“會當凌絕頂”時,才會看見“一覽眾山小”的雄偉泰山,進而感受詩人的心胸氣魄;因為有眼睛看才有“不畏浮云遮望眼,自緣身在最高層”登高覽勝的獨特感受……由此看來眼睛是心靈的功臣呢!
眼睛幾乎是人全部靈感和感悟的來源!不起眼的事物經過眼的審視和新的判別與理解而具有獨特的啟示,使人的心靈更充實,內涵更豐富。
多虧了眼睛,心靈才能有更多的啟示引導我們,不至于在道路上迷失方向;
多虧了心靈,眼睛才能充分欣賞一切美好的事物,從而陶醉心靈;
多虧了眼睛,心靈才得以將自己那獨有的才華向世人展現得那么精妙絕倫;
……
不久,我倆確定了戀愛關系,很快墜入了愛河,常常在夜幕降臨后,牽手漫步在幽靜的田間路邊,有時我輕聲唱歌,他口琴伴奏??措娪?,逛公園,彼此傾吐衷腸,加深著感情,也加深著了解。40多年后的今天,每每回憶起那段美好的時光,依然感覺甜蜜而溫馨。
我出生幾天母親就撒手西去,他很小被賣離家園,這近似的經歷,讓我們彼此更珍愛也更呵護對方。沒有海誓山盟的承諾,只有我精心剝出了100粒瓜子仁,看著他一粒粒吃完。我暗自發誓,今生今世百分之百地善待他。
在那特殊困難時期,我們沒有舉行婚禮,拜見了雙方老人,被褥一合結鳳鸞。廢木堆里挑了塊木板做菜板,舊鐵桶做成了爐子,溫馨火焰做三餐。我們先后生育三個兒女,沒有老人照管,全靠夫唱婦隨,齊心協力,日子再苦再累心里也是甜的。
然而,天有不測風云,21年前他意外遭遇車禍,至今我想起仍心驚膽戰。當時,他不省人事,血跡滿面,頸椎挫傷,上肢癱瘓。當時孩子們都還很小,我沒有驚動任何親人,日日夜夜守護在他身邊,給他講故事、唱歌、說笑話。愛情有著無堅不摧的力量,他奇跡般地康復了。這些年來,他在愛的滋養中身體強壯不減當年。
進入暮年的我多了不少生活的感悟。年輕時,我性子急,稍不如意就發脾氣。隨著時光的日積月累,我變得成熟,我感激老伴對我的寵愛與包容,所以無微不至地關心他的衣食住行。為老伴添歡樂,我自有妙招妙語:每當他幫別人修好電燈或家電,我便夸他是“及時雨”“活雷鋒”。還常幽默地捧他:心平似水,與世無爭,天下難得的好老公。我曾在給他的情書中寫道:“……你少吃一口飯似餓我幾天,你手上扎個刺如疼我心尖?!蔽以谫澝浪母柙~中充滿激情地唱道:“……你似珍珠藏我心間,你似神仙伴我身邊。咱們的幸福甜蜜,因為有你理解寬容、無私奉獻?!蔽覍习橛酶杪曎?,話語捧,張張紙上抒真情,怎不讓他笑盈盈?
不善言表的老伴在“甜言蜜語”的“激勵下”下對我更是體貼入微。我打個噴嚏或咳嗽一聲,他又催我喝水又讓我添衣。我寫文章時,他一會兒提醒我保護眼睛,一會兒把水果放在我桌邊;我學聲樂,他不厭其煩地教我識樂譜,為我一遍又一遍地伴奏,我常幸福而感慨地說:“我是掉進蜜罐里的人呀!”
教師要憑借各種教學手段,根據教學目標和學生存在的問題,通過具體、有趣的發散性問題創設真實有效的問題情境,營造出積極主動、積極探究的過程,讓學生在真實或模擬問題情境中,學會選擇和判斷;讓學生在道德沖突中探尋和建構;讓學生對善惡作出自己的評價,形成自己的觀念,踐行正確的道德準則。
筆者在《讓我們學會合作》教學時,從學生的角度出發,選擇貼近學生生活的內容去設計教學活動。這節課圍繞“什么是合作―合作的意義―怎樣合作―合作的樂趣”這一主線展開活動。以學生感興趣的活動貫穿課堂的始終,引導學生自主體驗,達到了人人在活動中獲得“合作”的真實感受。筆者一開始就以學生喜歡的表演形式走進課堂,讓學生萌發急于想探索“合作”的奧秘。同時注意創設寬松、有趣的活動環境,并掌握“合作”的技能,便于指導今后的學習、生活。同時通過游戲“同舟共濟”的開展,讓學生真正地感受到了合作的重要性與合作的樂趣。
2.踐行生活德育,深化情感體驗
生活是品德課程的基礎。我們要求學生用自己的眼睛觀察生活,用自己的心靈感悟生活,用自己的方式探究生活,提高生活的價值。只有源于兒童實際生活的教育活動才能引發他們內心而非表面的道德情感、真實而非虛假的道德體驗和道德認知。教師要關注學生現實的生活和未來可能的生活,把不同的生活場景搬進課堂,讓學生提煉生活場景,引導學生回歸到生活的本源中去。
在上《爭當“護牙小衛士”》課時,筆者用小藍臉和小紅臉的動畫,形象地讓學生明白細菌在牙齒中“安家”會給生活帶來什么樣的不便,并將視頻中的內容拉近到學生自己的生活,讓他們回憶自己或家人牙疼時不舒服的情景。接下來進行“誰是護牙小博士”的環節,讓孩子們懂得一些牙齒的小知識,了解換牙時的注意事項,了解正確的護牙方式,就能養成良好的護牙習慣。
3.開發課程資源,豐富品德課堂
魯潔教授說:“品德教學是實現人類經驗結晶的智慧與學生的經驗、智慧的融合,要在教材的普適性與學校所在場域的特殊性之間找到平衡點?!闭n程資源是開放性的、生成性的、多樣性的。教師要結合當地氣候特點、風土人情以及學生的學習準備等情況開發運用地方課程資源,豐富品德課堂。
教授《鄉音鄉情》時,筆者立足家鄉的實際情況,充分挖掘地方資源,引導學生通過聆聽鄉音,感受鄉情,品味民間文化當中體現出來的家鄉人的思想、情感和性格。在了解了家鄉人的智慧、家鄉傳統與進步的變革,見識了來自不同家鄉的文化瑰寶之后,筆者引導學生轉向廈門民間文化的探索,讓學生體驗鄉音鄉情與形成家鄉人獨特性格之間的關系,進而使學生從心靈深處,自發地產生一種作為家鄉人的自豪之情及熱愛家鄉、熱愛家鄉人的積極情感。
4.關注生命成長,直面學生心靈
蘇霍姆林斯基說:“在每個孩子心中最隱秘的一角,都有一根獨特的琴弦,撥動它就能發出特有的音響,要使孩子的心同教師講的話發出共鳴,教師自身就需要同孩子的心弦對準音調?!睆纳砷L的高度看,我們的品德課堂應該是在人本精神的指引下,通過構建適合學生生命成長的教學方式。根據孩子的個性特征,努力營造一個平等和諧的氛圍,進而幫助學生達到至善、立真、求美的境界。
眼睛是我們身體的重要器官。筆者在教學《保護眼睛》時,為了讓學生了解自己身體的基本特征,通過引導學生游戲、活動、觀察、思考、交流和小組討論,結合生活實際來表達自己的感受和想法。用家長、學生填寫評價表的方式督促學生,讓學生意識到眼睛對自己生活的重要作用,從中體會到愛護自己的身體,養好良好生活與衛生習慣的重要性。
5.關注活動品質,體現教育價值
有效的教育必須采用學生樂于和適于接受的生動活潑的活動方式。在注重活動方式的生動趣味時,要更多地去關注活動的內在品質,加深學生的情感體驗,提升學生的道德認知,深化學生的思維和認識水平。教師要設計豐富多樣的活動形式,吸引學生積極主動地參與交流、參與探索、參與匯報,從而有所收獲。