反向遺傳學研究方法

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反向遺傳學研究方法范文第1篇

這本教材由最近一次的流感大流行開始引出了目前流感研究中有待解決的問題，例如，病毒起源、傳播、發病機制、疾病的嚴重程度等。本教材還涵蓋了多領域最新流感研究進展，包括基因組學、能夠識別病毒毒力的反向遺傳學、1918年西班牙流感病毒株的分析重建等。

本書共分為8章：1.流感緒論，敘述了人類流感病毒以及流感大暴發的歷史。2.流感病毒的結構與復制，分別講述了流感病毒的結構、裝配過程、基因組、病毒的復制、病毒編碼蛋白、甲流乙流的質子通道、宿主與病毒功能的調控、流感病毒復制和PB1F2的結構和功能、發病機制等。3.流感病毒的進化與生態學，分別通過感染不同宿主的流感病毒詳述了其變異及進化知識；4.流行病調查；5-6.詳述了流感的免疫學，詳細介紹了先天免疫、抗體介導免疫、細胞介導免疫、免疫原性、流感疫苗、動物流感防控、流感疫苗生產；7.臨床與抗藥性方面的知識，包括致病機制、臨床表現、最新的抗藥性研究、流感病毒模型的構建；8.介紹了最近一次H7N9暴發的情況和研究進展。

本書不僅詳細形象地闡述了流行性感冒的歷史、流感病毒的病原學、流行病學以及實驗室診斷技術基礎，更突出流感病毒研究的最新進展、成果以及國際關注的熱點問題。本書的寫作深入淺出、通俗易懂，力求既能涵蓋全面的流感基礎知識，又能反映現階段流感研究的發展水平。

本書作為全面介紹流行性感冒的專業教材，既滿足各高等學校醫學類、生物類、生物工程類學科本科教學的需求，同時也滿足不同層次和其他相關專業研究生的教學需要。

馬雪征，碩士，助理研究員

反向遺傳學研究方法范文第2篇

反向遺傳技術為在DNA水平上對RNA病毒進行研究和操作提供了極為方便有用的工具。本研究構建了EV71全長cDNA克隆,并將體外轉錄得到的RNA轉染RD細胞,成功獲得拯救病毒,為進一步研究EV71病毒基因功能、基因變異與病毒毒力關系、基因疫苗等研究以及防控該病奠定良好的基礎。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株與細胞

EV71病毒株FJ08149是2008年從一手足口病病例皰疹液分離獲得,經鑒定為EV71 C4基因亞型。RD細胞由中國疾病預防控制中心脊灰實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑

長片段擴增Primescript RT-PCR Kit購自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA載體 購自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 購自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 購自Qiagen公司;EV71單克隆抗體購自Chemicon公司;FITC標記的二抗購自Dako公司。

1.2 引物設計與合成

根據FJ08149株的序列和酶切位點,設計了一對引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7啟動子序列及NotI酶切位點,下游引物EV71-3RM在其5'端引入52個Poly(T)及MluI酶切位點。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR擴增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑說明提取病毒RNA,最后用適量無RNA酶的雙蒸水溶解。根據長片段Primescript RT-PCR Kit說明書,先以EV71-3RM為反轉錄引物,在42℃反應1小時反轉錄全長cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS進行基因組全長擴增,PCR反應條件為:95℃預變性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40個循環;72℃ 10min。反應產物在0.7%瓊脂糖中電泳進行檢驗。

1.4 全長cDNA 的構建與鑒定

RT-PCR擴增產物經電泳后純化,以TA克隆方法將帶有T7啟動子識別序列的基因組全長連入TOPO-XL-PCR載體中,用MluI和NotI酶切鑒定是否插入目的片段。

1.5 體外轉錄與轉染RD細胞

用MluⅠ和NotI將有目的片段插入的質粒進行雙酶切線性化,純化后按照T7體外轉錄試劑盒說明在體外轉錄出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)試劑盒進行RNA純化后,加30ul無RNA酶的雙蒸水洗脫, 定量。按照Transfection reagent說明書要求把RNA轉染到培養于6孔細胞板RD細胞中, RNA含量為2μg/孔。轉染后每天觀察細胞,待細胞病變(CPE)達到75%及以上或觀察7天后,收獲細胞進行鑒定與傳代。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 RT-PCR鑒定及VP1序列測定

用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)診斷引物對拯救病毒進行鑒定。應用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT

TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)擴增包括VP1全長在內的1082bp產物,并進行序列測定分析。

1.6.2間接免疫熒光試驗鑒定

CPE達到75%及以上或觀察7天后,收集細胞及上清,2500rpm離心10min,取細胞沉淀用無菌PBS洗2次后,重懸細胞沉淀,滴加到熒光片,用丙酮將其固定,蒸鎦水清洗1次后加入EV71單克隆抗體,37℃濕盒中孵育1 h,PBS 洗滌3次。加入用1∶6000伊文斯蘭以1∶40 稀釋的FITC標記的兔抗鼠二抗,37℃濕盒中孵育1h,PBS洗滌3 次后甘油封孔,鏡檢。

1.6.3拯救病毒效價測定

獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后,與母本病毒同時進行TCID50測定。詳細方法及步驟參見《WHO脊髓灰質炎病毒實驗室手冊》[3]。

1.6.4電鏡觀察

獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后,反復凍融3 次,4500r/min 離心30 min,取上清濃縮5倍后,以1%加入EV71特異性抗體37 ℃孵育2h后,4℃過夜,10000r/min離心30 min,以PBS重懸沉淀,點樣、負染,電鏡觀察。

2結果

2.1 全長cDNA克隆的構建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM,從FJ08149病毒上清擴增出EV71基因組全長約7.5kb,見圖1A(marker不夠清晰)。應用TA克隆技術,將EV71基因組全長連接入PCR-XL-TOPO TA載體中,構建重組質粒,經MluI和NotI雙酶切鑒定,FJ08149T5和FJ08149T25兩個克隆質粒均有目的基因插入,見圖1B,目的基因約7.5kb,載體大小為3.5kb。

A: FJ08149株基因組PCR擴增產物

1.RT-PCR擴增后的全基因組產物(7.5kb);2.DNA Marker DL15,000;3. 陰性對照。B: TA 克隆NotI和MluI雙酶切鑒定結果;1.DNA Marker DL15,000;2.pFJ149T5;3.pFJ149T25

圖1基因組PCR產物及TA克隆酶切鑒定

2.2 體外轉錄制備感染性RNA

應用MluI和NotI雙酶切,從pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆質粒中切下含有T7啟動子的基因組DNA。并將此片段作為體外轉錄模板,通過T7 RNA聚合酶系統,體外轉錄成RNA,經電泳鑒定,轉錄的RNA達到預期的7.5Kb大小,見圖2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

圖2體外轉錄RNA電泳圖

2.3 病毒的拯救

轉錄RNA轉染RD細胞后72小時,即可見到典型的腸道病毒CPE,見圖3A,CPE呈逐日增多,7天后將轉染細胞培養上清以20%比例傳代,第3天CPE達到75%以上。對照細胞培養7天均仍保持正常形態,見圖3B。

A.轉染pFJ08149T5后的RD細胞B. 正常的RD細胞

圖 3RNA轉染RD后CPE形態

2.4 拯救病毒的鑒定

2.4.1間接免疫熒光鑒定

拯救病毒、拯救病毒傳1代后和母本病毒株用EV71單克隆抗體進行免疫熒光檢測,均可見到特異性的熒光,見圖4A,而細胞對照無熒光產生,見圖4B。

圖4拯救病毒的間接免疫熒光鑒定

2.4.2RT-PCR鑒定及序列分析

拯救病毒培養上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R進行擴增,均得到預期大小的目的片段,約226bp和1082bp,見圖5。將VP1全長序列測定分析,拯救病毒與母本病毒891個堿基完全一致。

圖5 拯救病毒的RT-PCR鑒定

2.4.3拯救病毒毒力效價測定

將拯救病毒與母本病毒同時進行病毒效價測定,結果pFJ08149T5的效價為105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效價為107.25TCID50/0.1mL,母本病毒FJ08149的效價為107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25與母本病毒對細胞的感染力相近,而pFJ08149T5約低100倍。

2.4.4病毒粒子的形態

濃縮后的FJ08149T5拯救病毒與EV71抗體作用后,形成免疫復合物,經負染色,電鏡下觀察到球形病毒粒子,直徑約22nm,見圖6。

圖6拯救病毒的免疫電鏡

3討論

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次應用反向遺傳學技術成功拯救出脊髓灰質炎病毒(PV)后[4],翻開了RNA病毒研究的新篇章,實現了在DNA水平上研究RNA病毒。通過構建cDNA感染性克隆,應用DNA基因操作方法,如定點突變、重組、缺失和嵌合等手段,研究拯救病毒基因水平的改變對表型的影響,進而達到對病毒基因功能與結構、致病機制、表達調控、分子免疫機理等的全面認識,開發出新型疫苗。日本學者Arita等,于2005年首先構建了EV71標準株BrCr的感染性克隆,然后利用基因置換,引入PV疫苗株(Sabin I)影響溫度敏感與病毒毒力的突變位點,在猴子模型上證實了溫度敏感的病毒株對猴子毒性減弱[5];2008年,他們又在NOD/SCID鼠模型中證實了幾個決定溫度敏感的突變位點在神經毒力減弱中起協同作用[6]。2008年以來EV71在中國大陸流行,迫切需要利用本土流行株構建感染性克隆,為研究其致病機理、病毒變異與毒力關系以及疫苗的研究提供技術支持。

由于PV等小RNA病毒的基因組是單股正鏈RNA分子,裸RNA分子就具有感染性,且基因組較小,如EV71等腸道病毒屬僅有7.5Kb大小,無帽子結構。理論上構建其感染性克隆可能較為容易,但在實際操作中仍然面臨著不少的困難。首先需獲得完整基因組的cDNA序列,先前基本上采取分段擴增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列,操作過程煩瑣,且多次克隆、連接也給基因序列突變增加了機率。本研究中通過長片段RT-PCR一次性擴增出全長基因組,一次克隆操作以盡量減少可能引入序列變異。第二,基因組3’端需有足夠長的Poly(A)尾,一定長度的Poly(A)對維持基因組穩定性及保證其感染性均有作用[7]。據報道,PV的Poly(A)如果少于20個,RNA的感染性比野生株會低20倍[8]。Sarnow等對3’端Poly(A)組成不同對PV體外轉錄本感染性影響的研究得到,Poly(A)尾越長其感染性越接近野生株,但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究設計時利用3’端引物直接帶入52個Poly(A)尾和一個MluI酶切位點,達到保證感染性同時可進行線性化的目的。第三,保證基因組忠實性,減少其它非基因組序列引入。本研究直接將T7啟動子特異性識別序列通過引物精確加到基因組5’端,并帶入NotI酶切位點,轉錄前通過雙酶切,避免將載體序列引入。第四,克隆擴增時如何避免因細菌增殖可能引起的序列變異,導致序列缺失或插入從而導致基因組序列不完整性。在本研究過程中也曾發現過類似的情況,因此采用了28℃、150rpm/min的低溫低轉速的優化培養條件,這是乙型腦炎病毒等其它感染性克隆構建過程也曾采取的措施[9]。本研究還發現如果基因組正向插入到載體T7啟動子下游,不僅細菌增殖緩慢且量少,質粒拷貝數低,且轉染也無感染性;而如果基因組以反向插入,則細菌不僅增殖快量大,質粒拷貝數高,且所獲得的幾株感染性克隆均為此反向插入的。這是否因不同方向插入時,潛在表達的蛋白質不同導致的,有待于進一步深入研究分析。

本研究應用本地分離株成功地構建了中國大陸流行C4基因亞型EV71感染性克隆,轉染RD細胞成功獲得了拯救病毒,經鑒定與野生株具有相似的遺傳特性與生物學性狀。此感染性克隆構建成功,可為下游研究提供了技術支持。

參考文獻:

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291293.

[2] 省略/n272442/n272530/n272757/appendix/doc7307.doc

[3] 世界衛生組織.脊髓灰質炎實驗室手冊[R].第4版.中國疾病預防控制中心:北京, 2004:78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981,214(11):916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005,86:1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008,82(4):1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989, 63(1):467-470.

反向遺傳學研究方法范文第3篇

【關鍵詞】 慢病毒

Construction and identification of lentiviral vector of RNA interference of Smad4 gene

【Abstract】 AIM: To construct a lentiviral vector of RNA interference (RNAi) of Smad4 gene. METHODS: The effective sequence of siRNA targeting Smad4 gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed， synthesized and cloned into the pLVTHM vector， which contained H1 promoter and green fluorescent protein (GFP). The resulting lentiviral vector containing Smad4 shRNA was named LVshSmad4， and it was confirmed by PCR and sequencing. 293T cells were cotransfected with lentiviral vector LVshSmad4，pCMVdR8.74 and pMD2G. All virus stocks were produced by calcium phosphatemediated transfection. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. RESULTS: PCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of Smad4 (LVshSmad4) producing Smad4 shRNA was constructed successfully. The titer of concentrated virus was 5×1010 pfu/L. CONCLUSION: The lentivirus RNAi vector of Smad4 was constructed successfully.

【Keywords】 RNA interference; Smad4; Neoplasms; Lentivirus

【摘要】 目的：構建Smad4基因RNAi慢病毒載體. 方法：針對已經篩選確定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM載體［含H1啟動子和綠色熒光蛋白（GFP）］連接產生LVshSmad4慢病毒載體，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定. 用LVshSmad4，pCMVdR8.74和pMD2G 3質粒共轉染包裝細胞293T細胞，包裝產生慢病毒，以293T細胞GFP蛋白的表達水平測定病毒滴度. 結果：PCR和測序證實，成功構建Smad4 shRNA的慢病毒載體LVshSmad4. 包裝慢病毒，濃縮病毒懸液的滴度為5×1010 pfu/L. 結論：成功構建人Smad4基因RNAi慢病毒載體.

【關鍵詞】 RNA干擾；Smad4；腫瘤；慢病毒

0引言

轉化生長因子β(TGFβ)Smad信號途徑在腫瘤發生機制中發揮重要作用. Smad4（deleted in pancreatic carcinoma locus 4， DPC4）在信號傳輸途徑中處于中樞地位，活化的RSmads與Smad4結合成寡聚物，將TGFβ的信號傳遞到核內，調節靶基因的轉錄并誘導下游基因的表達［1］. 近年來，RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術的出現，為研究內源性基因功能和信號轉導途徑提供了強有力的研究工具. 我們在已經獲取Smad4基因的RNAi有效靶序列的基礎上，設計、構建和鑒定表達Smad4 siRNA的慢病毒載體，為后期研究Smad4基因在腫瘤細胞中的作用機制和基因治療打下基礎.

1材料和方法

1.1材料采用慢病毒的包裝細胞293T細胞株（中科院上海細胞所）、大腸桿菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invotrogen公司）. 慢病毒載體系統（Tronolab公司tronolab.com/lentivectors.php）. 該病毒包裝系統由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G 3質粒組成，其中pLVTHM含有能持續表達小RNA的元件，同時能表達綠色熒光蛋白（GFP）. pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包裝所必須的元件. 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、大量質粒DNA提取試劑盒（Qiagen公司).

1.2方法

1.2.1構建表達shRNA慢病毒載體用Ambion公司的設計軟件，設計、合成3對針對Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列. 經分別構建質粒，轉染293細胞，據其對Smad4的抑制率，確定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4 mRNA第1848位，GenBank gi：34147555）. 設計并合成（上海吉凱基因化學技術公司）其shRNA的DNA Oligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGA

TCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（內含MluI和ClaI酶切位點，下劃線所示tronolab.com/lentivectors.php）. 經退火形成雙鏈DNA，與經MluI和ClaI雙酶切后的pLVTHM載體連接，轉化DH5大腸桿菌，挑取重組陽性克隆行PCR及測序鑒定（上海博亞生物技術有限公司）. PCR鑒定陽性克隆的primer: Up: 5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；Down: 5′TTATTCCCATGCGACGGTATC3′.

1.2.2慢病毒包裝細胞轉染用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，細胞密度為0.5×109/L時，重新接種于25 mL的細胞培養皿，37℃，50 mL/L CO2培養箱內培養，細胞密度達60%～70%時轉染. 制備慢病毒包裝系統中3種質粒DNA溶液（LVshSmad4 20 μg，pCMVdR8.74 15 μg，pMD2G 7.5 μg），無菌水定容至1800 μL， 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混勻，加入2×BBS緩沖鹽溶液2000 μL，室溫放置20～30 min. 將DNA磷酸鈣混合液轉移至含單層細胞的培養液中，混勻，培養12 h后棄去含有轉染混和物的培養液，加入PBS 15 mL，輕搖后棄去，重復該步驟3次. 然后每瓶細胞中加入含100 mL/L小牛血清的細胞培養液15 mL，繼續培養48 h. 收集轉染72 h的293T細胞上清液. 于4℃，4000 g離心10 min；以0.45 μm濾器過濾后置于40 mL超速離心管中，4℃，25 000 r/min離心20 min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解過夜. 次日，以10 μL每管分裝病毒液置于-70℃冰箱中保存. DMEM培養液重懸293T細胞至5×108/L， 在96孔板每孔中加100 μL重懸細胞. 取6個eppendorf管，每管中加入90 μL預熱的OptiMEM培養基， 加10 μL病毒顆粒于第1管，混勻，從第1管取10 μL混合液于下一管，混勻；依次稀釋病毒顆粒至第6管；將96孔板中培養基吸出，每孔加45 μL病毒顆粒稀釋液，37℃溫育8 h后，更換含100 mL/L FBS的培養液繼續培養. 倒置熒光顯微鏡下檢測GFP表達量，計算病毒滴度.

轉貼于 　　2結果

2．1陽性克隆的PCR鑒定Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，經退火形成雙鏈DNA，與經MluI和ClaI雙酶切后的pLVTHM載體連接，連接產物轉化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆，行PCR鑒定陽性克隆. 重組細菌克隆的PCR產物277 bp（插入片段為67 bp），以經雙酶切后沒有插入片段的pLVTHM空載體PCR產物210 bp為對照（圖1），鑒定結果與預期相符. 測序結果表明合成的Smad4 shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確（123~189），此時命名慢病毒重組載體為LVshSmad4(圖2).

M：Marker；1：對照；2：重組細菌克隆的PCR產物.

圖1PCR鑒定陽性克隆（略）

2．2慢病毒載體的包裝及滴度測定提取獲得500 μg重組質粒. 將慢病毒包裝系統中3種質粒共轉染293T細胞，在倒置顯微鏡下觀察各孔中GFP的表達量，病毒滴度為表達GFP的細胞數乘以相應稀釋倍數. 測定滴度為5×1010 pfu/L，說明有大量質粒轉入293T細胞，病毒成功包裝.

3討論

近年來TGFβSmad信號通路在惡性腫瘤中的研究是腫瘤信號轉導領域的一大熱點［1］. Smad4扮演抑癌基因的作用［2-4］. 利用Smad4在TGFβSmad通路中的處于中樞環節的機制，沉默敲除或者恢復Smad4，再研究其下游調節基因表達變化和生物學特性的改變，是倍受重視的研究思路［1］. RNAi技術的出現，成了一種新的反向遺傳學手段被廣泛地應用于基因功能分析、信號轉導通路研究和基因治療. 質粒介導RNAi有一定的局限性，轉染率低，基因抑制表達作用弱，持續時間短［2-5］，不適合體內實驗. 慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，以HIV1為基礎發展而得，具有許多優點，能夠轉染非分裂期細胞和分裂期細胞，而且病毒的遺傳物質能夠整合到宿主的基因組，將其用于腫瘤的基因治療，除比其他病毒載體更具優勢外，病毒的VSVG外殼使載體病毒顆粒具有更強的穩定性，慢病毒載體RNAi作用持久，同時擴大了載體感染細胞的范圍. 因此慢病毒載體是很有前途的基因治療載體. 最近，用慢病毒載體介導RNAi的幾項體內外研究［6-8］即顯示了該技術策略在內源性基因功能研究和基因治療前沿領域的重大意義.

基于目前尚無將RNAi技術應用于肝細胞癌Smad4的研究報道， 我們在篩選出Smad4基因RNAi的有效靶序列后，構建表達shRNA慢病毒載體，以進一步研究沉默Smad4基因對肝癌細胞生物學行為的影響并探討其機制. 為構建Smad4 shRNA慢病毒載體，購買了病毒包裝系統pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G質粒. 其中，pLVTHM質粒中含有H1啟動子，能在宿主細胞中持續表達siRNA，同時該質粒能表達由EF1（Elongation Factor）啟動子驅動的GFP，可用于病毒包裝時轉染效率及感染目的細胞的感染效率的檢測. pCMVdR8.74質粒中含有HIV病毒的Gag基因，編碼病毒主要的結構蛋白；Pol基因，編碼病毒特異性的酶；Rev基因，編碼調節Gag和Pol基因表達的調節因子. pMD2G質粒中含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白. 293T細胞是293細胞的一種，作為包裝細胞，在包裝后產生了高滴度的病毒顆粒，同時表達報告基因. 本結果表明，成功構建了含有GFP報告基因的Smad4基因shRNA慢病毒載體，為進一步研究Smad4基因在腫瘤中的作用機制和動物基因治療奠定基礎.

圖2慢病毒重組載體LVshSmad4的測序結果（略）.

【參考文獻】

［1］ 季國忠，王學浩. 轉化生長因子βSmad信號轉導通路在腫瘤發生中的作用［J］. 醫學研究生學報， 2005， 18(6):542-545.

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［4］ Imamura T， Kanai F， Kawakami T， et al. Proteomic analysis of the TGFbeta signaling pathway in pancreatic carcinoma cells using stable RNA interference to silence Smad4 expression［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004， 318(1): 289-296.

［5］ 唐紅衛，潘陽林，聶勇戰，等. Osteopontin特異性siRNA真核表達載體的構建及其在GC9811胃癌細胞中沉默效應的鑒定［J］. 第四軍醫大學學報， 2005，26(3)：202-205.

［6］ Singer O， Marr RA， Rockenstein E， et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model ［J］. Nat Neurosci， 2005， 8(10)： 1343-1349.

［7］ Wiznerowicz M， Trono D. Conditional suppression of cellular genes: Lentivirus vectormediated druginducible RNA interference ［J］. J Virol， 2003， 77(16): 8957-8951.

反向遺傳學研究方法范文第4篇

1917-1919年

歐洲爆發流感疫癥，導致2,000萬人死亡(第一次世界大戰的死亡人數只是850萬人)，是歷史上最嚴重的流感疫癥。

1957-1958年

1957年2月在中國貴州爆發(病毒可能是在1956年從蘇聯傳來)，其後散播至世界各地。全球受影響的人數占總人口的10%至30%，但死亡率較1919年的疫癥為低，約為總人口的0.25%。

1968-69年

流感從香港開始，全球的死亡人數達70萬人，其中美國就占3萬多人。

1976年

新澤西一名青年染上豬流感，引致恐慌會爆發新疫癥，於是大規模推行疫苗注射。

1986-1993

世界不同地區發生數宗人類染上豬流感的病案。

1997年

香港發生禽流感，原本只影響雞只的病毒亦令人類患病。香港政府下令層宰150萬雞只。受影響的人數為18人，其中6人死亡。

中國是全球流感高發國家之一，發病情況十分嚴重。由于流感流行，影響生產、學校停課、醫院病人驟增等問題和現象亦屢見不鮮，而且歷史上幾次流感大流行源于中國，因此，中國的流感監測工作對全球起著舉足輕重的作用。

衛生部高度重視流感的監測和防治工作，將流感列為重點防治的傳染病之一，加強對流感防治工作的領導，定期研究與部署流感防治工作，組織制定流感防治策略，進一步加大防治力度，目前已在全國31個省開展流感監測工作 。

隨著中國經濟的發展，人口流動頻繁，人口老齡化，流感高危人群比例不斷增加，流感的危害及其監測和防治工作的重要性也進一步引起了各級政府的高度重視 。

近年來，在中國，隨著人民生活水平的提高，醫藥衛生條件的改善和醫療保健知識的普及，人民群眾對流感的防治，尤其是流感疫苗的使用高度關注，流感疫苗的使用量比以前明顯增加。但是，流感疫苗使用不同于其它疫苗，在疫苗種類、接種對象、接種時間等方面都應進行科學的選擇。因此，衛生部組織制定了全國性的流感疫苗免疫策略，以指導各地科學、規范、有序地開展流感疫苗接種工作，更大程度地發揮流感疫苗的免疫預防作用，讓公眾了解關于流感疫苗使用的科學知識 。

目前，我國已建立了全國性流感監測網絡，并具備較好的工作基礎。我們將繼續加強和完善監測網絡的工作，使之成為系統、規范、靈敏、有效的監測網絡，收集各類監測信息和資料，綜合分析，為流感的預防和控制決策提供科學的依據。同時，要逐步開展和加強流感對人群健康的危害和對社會經濟的影響及流感疫苗效益等方面的研究。

根據流感監測和其它方面研究的結果，不斷對我國流感免疫策略進行修改和完善，以保護人民群眾健康，促進社會經濟發展。

流感病毒的快速診斷與流感疫情監測的研究

成果簡介：該課題研究建立了一套由3種快速診斷方法組成的可用于不同場合進行檢測的快速診斷方法，尤其是搖床吸附微量細胞板短期培養法是國內首次報導的一種快速診斷方法。建立了復蓋寧波市全市范圍的流感監測網絡，共檢測流感毒株330株，僅2004年就向國家流感中心上送流感毒株250株，其中50株被國家流感中心選送到世界衛生組織作為篩選流感疫苗的備用株。建立了寧波市2002年以來甲3型流感病毒HA1基因變異情況的基因進化樹。為寧波市今后的流感病毒防治提供了分子生物學的基礎。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：寧波市疾病預防控制中心

治流感病毒液及其制備方法

成果簡介：課題選用名貴中藥，采用高科技手段，發明專利產品“治流感病毒液”（對外宣傳和檢驗單為“東方神液”）。特點：見效快；降溫快；無副作用；能對付任何流感變異性病毒；預防感冒效果好；可能對“非典”有作用。該產品市場前景非常廣闊，據統計全世界63億人口，平均每人每年患感冒4次。該產品技術成熟，屬世界領先水平，先后經湖南、湖北、黑龍江、安徽、福建等省上萬人次應用效果確實好，但目前主要問題是：資金缺乏，無法投產。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：武漢巨英超王高科技有限公司

流感病毒快速檢測方法的建立及應用

成果簡介：建立了一種敏感、快速的流感病原的診斷方法。首先將病人咽拭子標本接種狗腎傳代細胞（MDCK Cell）培養24～48小時，可以使流感病毒在采集標本后立即在細胞內增殖，克服了流感病毒容易在常溫下失去繁殖能力，其RNA易降解的缺點。上述短時培養結束后，用流感特異性引物做反轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR），進一步檢測流感病毒基因，為臨床提供快速、特異檢測流感病毒基因，確定流感病毒感染與流行的方法。應用上述方法，在流感流行期，快速確定流感病原采取消毒、隔離等措施，防止流感流行，對適合使用疫苗者提供了幫助，取得了巨大的社會效益。

所處階段：中期階段

完成單位：中國醫科大學

我國馬流感病毒不同分離株生物學

成果簡介：本項目分離到了青海馬流感病毒株并采用病毒分離鑒定、血清學、病理學、動物感染試驗、反轉錄－聚合酶鏈式反應、核酸序列比較分析等綜合性手段，對該病毒株進行了深入的研究，證明該毒株為H_3N_8。經過基因組進行比較研究發現，該毒株與我國香港1992年分離毒株關系密切，血凝素基因核苷酸同源率達94%以上，神經氨酸酶基因同源率達96%以上，白基因核苷酸與歐美等國家的參考毒株同源率達96%以上，其他基因核苷酸的同源性也達90%以上，與1974年北京馬流感病毒株和1989年吉林馬流感病毒株明顯不同。研究表明我國青海省馬流感病毒分離株可能從歐洲經由香港傳入大陸。同時，又將其與其他兩個病毒株進行了比較。建立了該病的診斷方法，進行了疫苗制備的初步試驗以及明確了我國馬流感病毒在進化系統中的分子生物學地位，為我國防制馬流感提供了有效的技術平臺。本研究明確了我國馬流感病毒間遺傳演化關系，建立了馬流感HI和瓊擴診斷方法，并初步制備了馬流感滅活疫苗。

所處階段：中期階段

完成單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所

成人接種卡介苗（BCG）對流感預防作用的研究

成果簡介： 該課題研究通過接種BCG，提高人機體的非特異性免疫力，殺滅或遏制病原體，使流感病毒雖然感染人但不致病。本次研究結果，BCG接種對流感保護率達74.49%。該研究不僅國內，而且國外都未見到這類的研究報道。它是BCG用途的創新，擴大了BCG的使用范圍；開創了預防流感的新途徑，探索出預防流感的新方法，增加了人類征服流感的一種手段。BCG接種簡單易行，保護率高，費用低，時效長，實用性好。BCG一直廣泛使用在全球；是生物制品中最安全疫苗。使用范圍為全世界；使用對象幾乎為全人類。研究中尚未探討清楚BCG接種后防流感的機理。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：淮安市疾病預防控制中心

穿琥寧抑制流感病毒誘導狗腎傳代細胞凋亡的研究

成果簡介： 該研究國內外首次報告穿琥寧有抗HN和乙型流感病毒誘導MDCK細胞凋亡的作用，其作用與病毒唑相似，并從細胞基因調控著手研究病毒的致病機理及穿琥寧的抗病毒作用為臨床防治流感提供了新的實驗依據，增加了可信度；穿琥寧抑制HN和B型流感病毒誘導MDCK細胞AP的抑制率（IR）與利巴韋林類似，進一步證明穿琥寧是抗流感的良藥，對該藥在治療流感領域產生了積極的影響；南昌地區流感由甲型和乙型流感病毒引起，2000年3月發生的流行由甲型流感病毒所致，為制備疫苗和研究流感病毒提供了新的變異毒株；采用雞胚和狗腎傳代細胞（MDCK）分離流感病毒可提高病毒分離的陽性率。

所處階段：中期階段

完成單位：江西醫學院第四附屬醫院

H5N3亞型流感病毒細胞培養滅活疫苗的研究

成果簡介：H5N3細胞苗的研制填補了禽流感防制的一項空白，該研究居國際先進水平。查新結果表明，利用反向遺傳學技術構建全部基因都來自禽流感病毒的重組禽流感細胞疫苗株為國際上首次報道。rH5N3油乳劑滅活細胞苗免疫持續期和對強毒攻擊保護性完全達到了雞胚苗的效果。由于H5N3疫苗株全部基因都來源于禽流感病毒，生物安全程度高于由人－禽流感病毒拯救的重組病毒；保護性抗原基因來自國內最新流行株，因此疫苗株與流行株的抗原匹配性好，免疫效果確實。此外，采用常規的血清學方法就可以進行免疫與野毒感染家禽的鑒別診斷。

所處階段：初期階段

完成單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所

我國馬流感病毒不同分離株生物學特征的研究

成果簡介：本項目分離到了青海馬流感病毒株并采用病毒分離鑒定、血清學、病理學、動物感染試驗、反轉錄－聚合酶鏈式反應、核酸序列比較分析等綜合性手段，對該病毒株進行了深入的研究，證明該毒株為H_3N_8。經過基因組進行比較研究發現，該毒株與我國香港1992年分離毒株關系密切，血凝素基因核苷酸同源率達94%以上，神經氨酸酶基因同源率達96%以上，白基因核苷酸與歐美等國家的參考毒株同源率達96%以上，其他基因核苷酸的同源性也達90%以上，與1974年北京馬流感病毒株和1989年吉林馬流感病毒株明顯不同。研究表明我國青海省馬流感病毒分離株可能從歐洲經由香港傳入大陸。同時，又將其與其他兩個病毒株進行了比較。建立了該病的診斷方法，進行了疫苗制備的初步試驗以及明確了我國馬流感病毒在進化系統中的分子生物學地位，為我國防制馬流感提供了有效的技術平臺。

所處階段：中期階段

完成單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所

流感嗜血桿菌培養、鑒定及藥物敏感性研究

成果簡介：該研究對張家口貧困地區健康人群及呼吸道感染兒童HI攜帶及感染情況進行了調查研究，并對分離菌株進行生物分型及藥物敏感性研究，結果表明：不同年齡健康人群HI帶菌率不同；黃連、連翹、金蓮花等10種中草藥對HI菌株均有不同程度的抑菌作用，且黃連的抑菌作用最強。該研究達國內領先水平。

所處階段：初期階段

完成單位： 張家口醫學院

天津地區流感病毒分子流行病學和致病性的初步研究

成果簡介：本項目首次對天津地區分離的流感病毒進行基因序列分析，從分子水平上了解天津流感病毒的變異特點和規律。首次應用SSCP方法用于流感病毒HA1基因片段點突變的研究，并作為初步篩查流感病毒代表株的方法。比較了甲3亞型“O”相及“D”相毒株、乙型中Victoria與Yamagata系之間致細胞凋亡能力。該研究建立了一套檢測病毒的分子生物學實驗方法，為我市預防控制流感提供了病毒分子生物學依據，提高了應對衛生突發事件的能力。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：天津市衛生防病中心

禽H9N2流感病毒感染人的發現及其基因來源的研究

成果簡介：禽H9N2毒株能感染人，并能在自然界中發生基因重配，同時重配子能感染人均為國際上首次發現，此發現表明禽流感病毒能直接感染人，也可能原先對人不致病的禽流感病毒，通過基因重配形成了對人致病的重配子。因此上述發現味徹底揭開流感大流行株起源及我國流感多發的原因提供了新的科學依據，證實了禽流感味一種新出現的傳染病，為國際反生物恐怖及流感大流行防治策略制定提供了新內容。

所處階段：中期階段

完成單位：中國疾病預防控制中心病毒學研究所

抗流感藥奧司他韋（二氨基莽草酸酯）合成新工藝

成果簡介：該產品是其活性代謝產物的藥物前體，其活性代謝產物是強效的選擇性的流感病毒神經氨酸酶抑制劑。病毒神經氨酸酶活性對新形成的病毒顆粒從被感染細胞的釋放和感染性病毒在人體內進一步傳播是關鍵的。藥物的活性代謝產物抑制甲型和乙型流感病毒的神經氨酸酶。體外在很低的毫微克分子濃度即有抑制效應。在體外觀察到活性代謝產物抑制流感病毒生長，在體內也觀察到其抑制流感病毒的復制和致病性。該產品通過抑制病毒從被感染的細胞中釋放，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。以具有莽草酸骨架結構的1-環己烯-4-酮甲酸乙酯為起始原料，經10步反應合成奧司他韋的工藝過程具有新穎性。

所處階段：初期階段

完成單位：南京萊因醫藥科技有限公司

雙重實時熒光定量RT-PCR快速檢測A、B型流感病毒的研究

成果簡介：該研究利用雙重實時熒光定量RT-PCR技術建立一種快速檢測A、B型流感病毒的方法。根據A型流感M基因和B型流感HA基因的相對保守序列分別設計一對引物及其相應的Taqman探針，建立、優化單一和雙重反應體系后，利用十倍稀釋法對已知滴度的流感病毒進行梯度稀釋，檢驗方法的靈敏度并建立相對定量標準曲線。結果表明，A型、B型流感病毒雙重反應的靈敏度分別為2.56 × 10^(-5)和5.0 × 10^(-5) TCID50，說明雙重反應中A、B型的引物、探針、模板之間無相互干擾，具有很好的穩定性和重現性。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：深圳市疾病預防控制中心

鴨、鵝、豬H5、H7亞型和A型流感病毒通用型抗體檢測力法的研究

成果簡介：以桿狀病毒為表達載體，表達了禽流感病毒的白基因，與流感病毒白具有相同的生物活性。重組病毒表達產物與流感病毒抗血清作免疫瓊脂雙向擴散試驗，均出現明顯清晰的沉淀線，與全病毒瓊擴抗原出的沉淀線完全吻合。用重組桿狀病毒的表達產物制備了A型流感病毒及鴨、蛾、豬H5、H7亞型病毒通用型重組白抗原，H5、H7亞型流感病毒的HI分型抗原和血清。建立了以NP為檢測抗原鴨、鵝型禽流感間接ELISA檢測方法，以全病毒作為抗原建立了豬流感抗體間接ELISA診斷方法，確立了最佳反應條件和術式。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所

克感利咽口服液的新藥研究及其抗流感病毒的免疫―自由基機理

成果簡介：本課題研制了克感利咽口服液（克感液），并從整體水平、器官水平、細胞水平和亞分子水平進行了多層次、多指標的綜合研究。肯定了克感液的抗流感病毒作用，并首次提出抗病毒的免疫-自由基機理和中藥在抗病毒作用中的重要地位。證明了中藥復方克感液可通過調節機體氧化應激水平起到非常重要的治療流感作用。此外還通過黃嘌呤氧化酶體系發光法和全血吞噬化學發光法，證明了克感利咽口服液具有較強的清除活性氧作用。為克感利咽口服液能降低氧化應激水平并參與抗病毒的免疫－自由基機制提供了可靠的實驗依據。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：中國中醫科學院廣安門醫院/中國中醫科學院第二臨床醫藥研究所

我國兒科流感嗜血桿菌性疾病及分離株耐藥分子流行病學研究

成果簡介： 該研究從建立流感嗜血桿菌b型（Hib）標準化診斷技術和感染菌株分子生物學研究平臺入手，引入國外先進培養分離技術、建立多種特異性抗原、抗體檢測方法、基因診斷和分型方法，為其感染和耐藥的流行病學研究提供有效工具。該項目進行了以人群（合肥市）為基礎、前瞻性、小兒化膿性腦膜炎三年流行病學監測，并進行了兩次以醫院(北京兒童醫院)為基礎小兒化膿性腦膜炎病原學調查。連續五年對北京、上海、廣州三所兒童醫院隨機選取5059例上呼吸道感染兒童進行Hi鼻咽攜帶和菌株常用抗生素敏感性監測，并采用分子生物學方法對氨芐青霉素耐藥菌株進行耐藥機制和基因分型研究。

所處階段：中期階段

完成單位：首都醫科大學附屬北京兒童醫院

廣州地區呼吸道感染兒童流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌攜菌和耐藥監測及分離鑒定方法的研究

成果簡介：該研究首次在廣州地區進行了連續5年兒童呼吸道感染肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌耐藥監測。首次對流感嗜血桿菌耐藥性的季節分布、性別差異、健康兒和上呼吸道感染兒攜流感嗜血桿菌和耐藥性的比較、耐藥表型的分布、多重耐藥等方面進行全面、系統地研究,建立了一整套完整的對菌株的保存，復蘇的技術。首次用克林霉素紙片法檢測廣州地區對紅霉素耐藥的肺炎鏈球菌中ermB及mefE基因分布，并比較ermB基因與mefE基因對紅霉素耐藥的肺炎鏈球菌的耐藥性；篩選出廣州地區治療兒童流感嗜血桿菌感染的一線藥物以二代頭孢菌素和/或青霉素類/克拉維酸為首選，治療兒童肺炎鏈球菌感染的一線藥物以青霉素/克拉維酸類藥物為首選。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：廣州市兒童醫院

豬型（H1N1）和馬2（H3N8）亞型流感病毒發現的意義及其來源的研究

成果簡介：該項目采用現場與實驗室相結合，走協作道路，應用了綜合性方法，即從一般的生物學至當今國際上先進的分子生物學技術。這樣全面系統的研究方式在國內實屬罕見，在國際上也屬先進之列。不僅使實驗結果更加可信和可靠，而且也保證了實驗在較高的水平上進行。豬型（H1N1）流感病毒于1930年就已從美國豬群中分離到，而后陸續蔓延到歐洲和亞洲，我國從1976年開始尋找它在豬群中人群中存在的線索，但1991年之前均未能找到它，更未能找到被豬型病毒感染的患者。同樣，馬2（H3N8）亞型毒株于1963年已從美國邁阿密馬群中被發現，而后波及到歐洲和亞洲。

所處階段：中期階段

完成單位：中國疾病預防控制中心病毒學研究所

豬流感（H1-H3亞型單價和H1-H3亞型雙價）氫氧化鋁膠滅活疫苗的研究及應用

成果簡介：該項目對分離自中國不同地區、不同亞型SIV流行株的生物學特性進行了研究，篩選出免疫原性好，與全國范圍流行的H1N1和H3N2亞型各抗原群均有很好抗原反應性，對雞胚高滴度適應的流行株作為種毒，接種非免疫雞胚大量增殖后收取無菌尿囊液，滅活使病毒失去感染和復制能力但保持其良好的免疫原性；含豬流感病毒尿囊液的蛋白質抗原與氫氧化鋁膠混合、濃縮，制成的滅活疫苗，可較長期存留在豬體，持續釋放抗原并刺激豬內持續產生特異性抗H1N1或（和）H3N2亞型豬流感，保護率高，免疫效果確實，免疫期持續時間長，可有效降低高熱、咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，增加平均日增重，顯著改善飼料轉化率。適用于中國不同地區豬場和豬群對H1N1和H3N2亞型流感的預防和緊急免疫。

所處階段：成熟應用階段

完成單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所

雞新城疫－流感－傳染性囊病－腎（腺胃）型傳支四聯油乳油劑滅活苗的研究

成果簡介：該課題用新城疫病毒Clone30株和從河北省自行分離的禽流感病毒A/雞/河北/9901/1/99株、傳支病毒腎型S株和腺胃型C株、傳染性囊病病毒EBV91株研制成四聯油苗，該聯苗在4-8℃保存12個月，20-25℃保存3個月不影響免疫效果，用該疫苗免疫15日齡雛雞后14天保護率達90%以上，免疫期達6個月。該研究達國內領先水平。