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      略談克隆細胞的醫學作用

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      略談克隆細胞的醫學作用

      一、資料

      純化產物的鑒定純化產物經Westernblot分析,無雜帶(圖略)。純化的重組MSP1α和MSP1β蛋白純度分別可達93%和91%。重組表達質粒的鑒定以重組質粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β為模板進行PCR擴增,擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見774和2300bp的目的基因條帶,大小與預期相符;重組質粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β的雙酶切產物可見774和2300bp的目的基因片段,大小與預期相符。MSP1α與MSP1β基因測序結果與GenBank上登錄的基因序列核苷酸同源性均達95.5%,氨基酸同源性分別達89.5%和90.0%。表達產物的鑒定重組菌的最佳誘導時間均是4h,表達產物經12%SDS-PAGE分析,可見相對分子質量約58000的MSP1α蛋白條帶及107000的MSP1β蛋白條帶,大小與預期相符。表達的目的蛋白主要以包涵體形式存在,MSP1α和MSP1β表達量分別占菌體總蛋白的31%和14%。

      二、重組蛋白免疫原性的鑒定

      在相對分子質量約58000和107000處可見特異性反應條帶,而陰性對照(MSP1α蛋白加入兔抗MSP1β血清或MSP1β蛋白加入免抗MSP1α血清)無此條帶重組蛋白在大腸埃希菌外膜的表達IFA法檢測結果顯示,免疫前的IgY抗體不能與表達MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發生反應,而1∶800稀釋度以上的抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可與表達MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發生反應。。重組蛋白對牛紅細胞的黏附作用HA檢測結果顯示,重組MSP1α和MSP1β蛋白可黏附至牛紅細胞上,表達MSP1α蛋白的重組菌對紅細胞的吸附率為56.4%,表達MSP1β蛋白的重組菌對紅細胞的吸附率為52.7%,空菌體對紅細胞的吸附率僅為9.6%,見圖7。HI檢測結果顯示,經抗MSP1α和MSP1β的IgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞的吸附率分別為6.8%和9.4%,經PBS處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞吸附率分別為53.2%和49.3%3討論Viseshakul等于2000年從佛羅里達分離株中分離的A.marginale對MSP1β基因的測序明確了兩個編碼MSP1β1和MSP1β2全長基因。Camacho-Nuez等也于2000年從佛羅里達分離株中發現另外3條MSP1β全長基因。MSP1α細胞外氨基末端區域包含串聯重復序列,這些序列與A.marginale對牛紅細胞和蜱細胞的黏附密切相關。MSP1α與A.marginale通過蜱的感染及傳播有關。本實驗中表達的重組MSP1α和MSP1β蛋白可誘導兔和雞產生特異性的抗體,該抗體可與重組MSP1α和MSP1β蛋白發生特異性反應;MSP1α和MSP1β蛋白可在大腸埃希菌細胞外膜上表達,無表達時采用IFA檢測,熒光強度減弱,表明MSP1α和MSP1β蛋白可能是A.marginale對蜱和牛紅細胞黏附力的基礎。重組MSP1α和MSP1β蛋白在大腸埃希菌表面可凝集牛紅細胞,而抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可抑制該凝集,提示MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞有黏附功能。HA試驗結果顯示,重組MSP1α蛋白對紅細胞的吸附率為56.4%,而重組MSP1β蛋白對紅細胞的吸附率為52.7%。經抗MSP1α和MSP1βIgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白,對紅細胞的吸附率分別僅有6.8%和9.4%,與Tamekuni等的研究結果相似,Tamekuni等認為A.mar-ginale能識別牛紅細胞的表面受體,并可相互作用,表明MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞有黏附功能。

      三、總結

      綜上所述,本實驗闡明了A.marginale中MSP1α和MSP1β重組蛋白菌外膜上獲得有效表達,并確認了MSP1α和MSP1β蛋白在侵入紅血球過程中起到黏附素的作用,表明這2種蛋白在控制牛A.marginale感染方面具有重要作用。以其為研究對象進行A.marginale亞單位疫苗的研制也取得了相應的成果。隨著對牛邊緣無漿體病認識的不斷深入,與其相關的基礎研究和應用研究必將得到進一步開展,尤其在該病的防控、致病機理及新型疫苗研制等方面將取得突破性的進展。

      作者:胡林森單位:新疆國防大學

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