牛血清白蛋白
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牛血清白蛋白范文第1篇
目的研究龍葵對大鼠實驗性腎炎的藥理作用。方法采用靜脈注射小牛血清白蛋白造成大鼠腎炎模型，按體重給予龍葵提取物35 d，觀察龍葵給藥后大鼠各項指標的變化。結果龍葵提取物可使給藥組動物24 h尿蛋白排出明顯減少，血清尿素氮及血清肌酐含量顯著降低，大鼠腎小管內的蛋白管型大小和數量明顯減少，灶性出血明顯少于模型組。結論龍葵提取物對小牛血清白蛋白所致大鼠實驗性腎炎有明顯的防治作用。
【關鍵詞】 龍葵提取物 大鼠 實驗性腎炎
慢性腎炎在臨床上是一種多發病、常見病，較難治愈，臨床上以蛋白尿為常用診斷指標，而目前仍以激素及免疫抑制劑為主要治療手段。近年來，以中醫藥治療慢性腎炎已成為研究的熱點。龍葵為茄科茄屬植物龍葵Solanum nigrum L.的全草，含有多種化學成分及藥理作用，藥源廣泛，易于采集，具有相當重要的生產及研究價值。本實驗采用小牛血清白蛋白所致的大鼠實驗性腎炎模型來觀察龍葵提取物的藥理作用，現將結果報道如下。
1 材料與儀器
1.1 動物SD大鼠，各半，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（滬）2007-0005。
1.2 試藥龍葵提取物(0.2 g/丸)：含生藥2.278 g/g，批號20071115，江蘇省中醫藥研究院制劑室提供；濟生腎氣丸：6 g/丸，國藥準字Z12020082，批號20070106，天津中新藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠。加蒸餾水研勻，配成適宜濃度的混懸液備用；小牛血清白蛋白：1g/瓶，批號20070601，上海生物化學公司進口分裝；尿蛋白試劑盒（批號20070625）、肌酐試劑盒（批號20070606）、尿素氮試劑盒（批號20070606）由南京建成生物工程公司生產。
1.3 儀器 貝克曼DU-640紫外分光光度計，美國產；HH-60型快速恒溫數顯水浴箱，常州國華電器有限公司生產；大鼠代謝籠：蘇州實驗動物籠具廠生產；Axioskop 2 plus 高級生物顯微鏡及Axiovision 圖象分析處理系統：德國ZEISS公司生產。
2 方法與結果［1～3］
大鼠60只，各半，體重180～220 g，隨機分為6組，即：正常組、模型組、濟生腎氣丸組(2.5 g生藥/kg)、龍葵提取物高(2.5 g生藥/kg)、中(1.25 g生藥/kg)、低劑量組(0.75 g生藥/kg)。大鼠按組開始給藥，正常組及模型組均灌胃給予同體積的蒸餾水，共給藥35 d。于第14天，除正常組外，其余大鼠均一次性尾靜脈注射小牛血清白蛋白1 g/kg。給藥35 d后，將大鼠置于代謝籠，收集24 h尿，并測定尿蛋白含量，同時采血分離血清，測定血清中肌酐、尿素氮濃度。最后將大鼠處死，兩側腎臟固定于10%甲醛中，作病理組織學檢查，病變程度由-、+、++、+++分別計為1，2，3，4分，并由Axiovision 圖象分析系統記錄和分析病理組織學圖片。實驗結果均采用組間t檢驗進行統計。實驗結果見表1～2。
由表1～2可見，模型組大鼠24 h尿蛋白排出量明顯高于正常組，血清肌酐及血清尿素氮含量均比正常組有顯著增高，而24 h尿量未見明顯變化。本品給藥組大鼠24 h尿蛋白排出量比模型組明顯減少，血清肌酐及血清尿素氮水平均顯著降低。病理鏡檢可見，模型組大鼠腎小球數目約17～20個/10×10視野，皮質及髓質內部分腎小管內見片狀紅染透明的蛋白管型，腎間質內可見灶性出血，偶見皮質內小管周圍小灶性淋巴漿細胞浸潤。而給藥組大鼠腎小管內的蛋白管型大小和數量明顯減少，灶性出血明顯少于模型組。
表1 龍葵提取物對小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠尿蛋白及血清生化指標的影響（略）
與模型組比較，*P
表2 龍葵提取物對小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠病理指標的影響（略）
與模型組比較，*P
3 討論
本實驗采用小牛血清白蛋白所致的大鼠實驗性腎炎模型來觀察龍葵提取物的藥理作用。實驗結果表明，龍葵提取物能顯著減少小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠的尿蛋白排出，降低血清肌酐和血清尿素氮水平。病理結果顯示，模型組與正常對照組比較，其腎小球數無明顯變化，但蛋白管型及出血灶明顯高于正常對照組，而龍葵提取物各給藥組蛋白管型明顯減少，出血灶明顯減少。上述結果表明，龍葵提取物對小牛血清白蛋白引起的大鼠實驗性腎炎有較顯著的改善作用。這也從實驗方面為龍葵應用于臨床提供了理論依據。
參考文獻
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牛血清白蛋白范文第2篇
關鍵詞：有機牦牛；背最長??；冷藏肉；生鮮肉；蛋白質組學
肉類產品食用品質的大幅下降引發了人們對現代肉品品質及其評價標準的深入思考，尋找一種科學的肉品品質評價方法并對其品質進行控制已成為國內外研究的熱點。肉品品質的形成機理與肉質性狀高度相關，而幾乎所有的肉質性狀都受到復雜的基因和蛋白質調控。已有的研究主要集中在對豬肉等肉質進行感官、理化特性和組織學特性的評價，尚未見到應用差異蛋白質組學方法對青藏高原有機牦牛宰后生鮮肉及冷藏肉品質的形成機理、評價和控制進行研究的報道。
本研究以同一飼養環境和屠宰條件，宰后以不同貯藏溫度（4、18 ℃）、不同貯藏時間（0、24 h）的生鮮和冷藏有機牦牛肉作為研究對象，以差異蛋白質組學技術為研究平臺，篩選與分析生鮮和冷藏的有機牦牛背最長肌肌肉的差異蛋白質，為進一步探討有機牦牛肌肉加工過程蛋白質的降解規律提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
青藏高原有機牦牛背最長肌肌肉組織取自青海省河南縣有機牦牛背最長?。ǖ谄吒刈档阶詈笠桓刈担?，保存備用。
2D裂解液、蛋白質定量試劑盒、IPG緩沖液 美國Bio-Rad公司；尿素、硫脲、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（3-（3-cholamidopropyl）dimethylammoniopropanesulfonic acid，CHAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、Tris-HCl、甘油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、甘氨酸 美國Sigma公司；
其余試劑為國產分析純。
1.2 儀器與設備
雙向凝膠電泳系統、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干膠條、Image Master 2D Platinum凝膠成像系統 美國GE公司；PD Quest軟件 美國
Bio-Rad公司；5800基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF） 美國AB SCIEX公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品制備
生鮮（宰后18 ℃、0 h）和冷藏（宰后4 ℃、24 h）有機牦牛背最長肌肌肉樣品每份取約0.5 g，加入1 mL 2D裂解液，勻漿（4 m/s、勻漿15 s、停頓2 min），勻漿間隙放于冰上冷卻，重復操作3 次[1]。再對勻漿液進行冰浴超聲破碎（100 W、超聲10 s、間歇15 s），重復操作10 次，13 400 r/min條件下離心15 min，取上清液。
1.3.2 蛋白質定量
采用Bradford法進行蛋白質定量，于-80 ℃保存備用。
1.3.3 雙向電泳
取總蛋白提取物100 μg，上樣量為450 μL，pH 3～10非線性IPG膠條17 cm進行等電聚焦電泳，條件為：30 V、12h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h。等電聚焦結束后采用12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）膠進行垂直電泳，條件為：15 mA/膠、30 min，30 mA/膠至溴酚藍離膠下沿0.5 cm。垂直電泳結束采用銀染法進行凝膠染色。
1.3.4 圖像采集
采用Image Master 2D Platinum凝膠成像系統對凝膠進行灰度掃描。所獲得掃描圖像通過PD Quest分析軟件進行差異蛋白質組分析。
1.3.5 質譜分析及蛋白質數據庫檢索
采用5800 MALDI-TOF/TOF質譜儀對差異蛋白進行質譜檢測。生物質譜的操作過程：切膠膠內酶解
ZipTip脫鹽抽提酶解肽段MALDI-TOF-TOF質譜測試數據分析蛋白質鑒定。利用Mascot軟件搜索Uniport、Swiss-Port數據庫尋找匹配的相關蛋白質。
2 結果與分析
2.1 Bradford定量
采用Bradford方法利用Nano Photometer P360超微量分光光度計對生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉全蛋白質提取量進行測定。以1 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液制作標準曲線，以蛋白質含量（mg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得出y=0.003x-0.020（R2=0.988）。由標準曲線公式可知，標準曲線線性關系良好，可以用于實驗蛋白質含量的測定。
2.2 雙向電泳
經雙向電泳及銀染后獲得生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉全蛋白雙向電泳圖譜（圖1）及差異蛋白在2-DE圖譜中的位置（圖2）。匹配后利用PD Quest軟件分析篩選差異點，實驗結果顯示雙向電泳圖譜具有較高的重復性，匹配率為75%。
通過PD Quest軟件對蛋白圖譜進行分析，生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉組織的雙向電泳凝膠的平均蛋白點數分別為1 840±181和2 034±86，其中具有統計學意義（P
2.3 質譜分析
選取PD Quest軟件檢測相對含量差異3 倍或3 倍以上的蛋白質點，手動取出凝膠上差異的蛋白質斑點（共計36 個蛋白質點），裝入1.5 mL離心管中超純水沖洗干凈后進行MALDI-TOF-TOF質譜檢測，結果得到7 個匹配有意義的差異蛋白質質譜鑒定結果（表1）。其中，生鮮有機牦牛背最長肌肌肉比冷藏的磷酸丙糖異構酶和熱休克蛋白β-6含量上調，其余含量下調。
3 討 論
運用蛋白質組學技術對動物肌肉貯藏過程中蛋白質組分變化的研究是目前研究的熱點之一。幾乎所有動物肌肉組織的蛋白質表達譜都有研究，針對青藏高原特有物種――有機牦牛，僅有少量關于感官、系水力、嫩度等理化性質方面的研究資料[2-3]，而對宰后生鮮肉及冷鮮肉品質的形成機理、評價和控制方面的研究則鮮見報道。有機牦牛肉品質是影響其商品價值的重要因素之一，因其具有復雜而多元的特性，所以研究屠宰后生鮮和冷鮮牦牛肉蛋白質變化的生理生化機制及其對嫩度等肉質性狀的作用，對于探討有機牦牛肉肌肉生長與肉品品質間的相關性以及貨架期的生化反應特點具有重要的意義。
據報道，動物屠宰后肌肉細胞在一定時間內開始死亡，并根據細胞類型發生一系列獨特、復雜的分子變化。動物血液循環終止后供氧停止，且不能去除新陳代謝產物，肌內糖原酵解導致乳酸積累，pH值降低，進而導致肌肉持水能力降低及鈣離子釋放，肌球蛋白與肌動蛋白間形成交聯橋[4]。本研究發現了7 種在生鮮牦牛肉和冷藏牦牛肉背最長肌中含量有顯著差異的蛋白質，其中TPI及KRT4蛋白、肌球蛋白-6、AKI4蛋白質是糖酵解和三羧酸循環的關鍵蛋白質。在有機牦牛肉中TPI和HSP β-6含量上調，肌球蛋白-6和AKI4含量下調，其原因可能是宰后肌肉為滿足ATP供應而提高了厭氧能量代謝，這些差異蛋白質與肉品性狀顯著相關。Jia等[5]應用蛋白質組學方法研究牛過度生長的現象，結果表明肌肉生長抑制素基因上有11 對堿基缺失導致了13 種肌肉蛋白質發生了改變，包括收縮蛋白和代謝蛋白，這些蛋白質大部分是來自有收縮性的器官組織，并能夠加快肌纖維的收縮功能，這與本研究結果相似。另外Lomiwes等[6]利用蛋白質組分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48 h肌肉的蛋白質組樣品，這些肌肉蛋白質為5～200 kD不等，pH值為4～9，結果發現蛋白質組模式發生了15 種顯著變化。Kim[7]、毛衍偉[8]等指出羊的雙肌臀突變導致臀部肌肉異常發達主要是由于18號染色體的突變，導致鈣激活中性蛋白酶抑制蛋白的活性增強了2～3 倍。
近幾年通過蛋白質組學的研究，揭示了結構蛋白、糖酵解酶和熱休克蛋白/伴生蛋白在肌肉嫩化中的作用[9-11]。
研究發現，根據嫩度將牛背最長肌分組，使用熒光差異雙向電泳技術分析其蛋白質組后發現，表達存在差異的蛋白包括糖酵解酶和結構蛋白，高嫩度牛肉樣品的肌漿蛋白質組分中肌球蛋白輕鏈的量相對較高，可以作為預測牛肉蛋白水解和最終嫩度的標記蛋白質[12-14]。
Dutaud等[15]研究表明，安格斯牛肉宰后成熟過程中3 種蛋白表達量降低可能由于發生了等電點沉淀，推測有機牦牛肉成熟過程中表達量降低可能由于pH值的降低，發生等電點沉淀所造成。
綜上所述，通過雙向凝膠電泳結合生物質譜技術測定生鮮和冷藏有機牦牛背最長肌肌肉差異蛋白質，初步篩選出生鮮肉與冷藏肉的差異表達蛋白質，涉及糖酵解蛋白、熱應激蛋白、結構蛋白等，說明這些蛋白在有機牦牛肉貯藏過程中對肉品質的影響發揮了重要的作用。
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牛血清白蛋白范文第3篇
【關鍵詞】 腎小球腎炎；動物模型；造模機制；造模方法
腎小球腎炎是由多種病理類型的原發性腎小球疾病發展而來的，以血尿、蛋白尿、高血壓和水腫為主要臨床表現的慢性疾病。目前認為腎小球腎炎是一種自身免疫反應性疾病，通過免疫作用而造成腎臟損害。
1 Heymann腎炎模型
本模型是通過針對自身抗原的免疫復合物（IC）誘發而成，故稱其為自身免疫復合物性腎炎（autologous immunecomplex，AIC）。Heymann腎炎模型根據是否由同種動物提供抗體分為主動型和被動型兩種模型。主動型Heymann腎炎模型機制:動物由自體抗腎抗體或自體抗原抗體復合物刺激引起腎小球基膜產生免疫反應形成腎炎。被動型Heymann腎炎模型機制：用甲種動物的腎皮質勻漿免疫乙種動物，使后者產生抗甲種動物的抗腎血清（抗腎抗體），然后將這種抗腎血清注射給健康的甲種動物，而使其產生腎炎。主動型Heymann腎炎，孫永寧［1］用大鼠腎皮質勻漿加弗氏完全佐劑制備乳化液，同種大鼠腹腔注射次乳化液，2 ml/只，每周注射1次，共注射7次?，F研究常用模型為被動型Heymann腎炎模型。其具體造模方法［2］為大鼠后足墊注射含6.5 mg免疫γ球蛋白的完全弗氏佐劑0.25 ml后，由大鼠尾靜脈注射1.0 ml兔抗FXIA抗血清，qd，共2天，造模完成。這一實驗模型與人類原發性膜性腎病非常相似，其特征為彌漫性基膜增厚伴釘突形成。
2 原位免疫復合物性
腎炎模型該模型的特點是在腎小球基膜上直接形成免疫復合物。由細菌感染合并異種免疫蛋白聯合作用造成模型。楊宏等［3］制作家兔原位免疫復合物腎小球腎炎模型:將大腸桿菌毒素和陽離子化牛血清白蛋白（BSA）溶于0.15 mol/L、pH值為7.2的磷酸緩沖液（PBS）溶液中，最終濃度為每1 ml溶液中含1 μg大腸桿菌毒素和1 mg牛血清白蛋白，每只兔經耳緣靜脈注射2 ml預免疫，7天后開始正式免疫造模:每只免疫兔每天經耳緣靜脈給予陽離子化牛血清白蛋白20 mg（預先溶于PBS溶液中），共7周。腎臟組織學檢查顯膜性腎小球腎炎的典型病變，故一般認為，膜性腎炎病理模型是原位免疫復合物性腎炎模型的典型病理代表。
3 馬杉腎炎
此模型［4］又稱Masugi腎炎、腎毒血清性腎炎、大鼠抗腎小球基膜（GBM）腎炎。其基本原理［5］是以A種動物的腎小球基膜作為抗原，與完全佐劑一起注射到B種動物身上，使之產生抗A種動物的腎小球基膜抗體，將含有此種抗體的B種動物血清給A種動物靜脈注射，A種動物經過一定的潛伏期之后尿中出現明顯蛋白，伴腎小球增生，終至新月體形成與完全纖維化改變，是利用異體抗GBM抗體直接誘導后產生的具有典型的人類新月體性腎炎病理變化的動物模型［6］。畢柳等［7］報道，英國Kazuhiro等用牛腎小球基膜免疫Wistar大鼠造成實驗性自身免疫抗腎小球基膜腎小球腎炎。伍小波等［8］用鼠腎皮質勻漿每周3次，每次10 ml免疫大耳白兔，在最后加強免疫后第11天，從兔耳緣靜脈采血測效價，利用雙向瓊脂擴散法測定兔抗大鼠GBM-Ab的效價為1∶16，收獲血清-30 ℃保存備用。正常兔IgG加等量完全弗氏佐劑皮下注射SD大鼠進行預免疫，預免疫后第7天和第8天后從大鼠尾靜脈注射稀釋一倍兔血清，劑量1 ml/只，連續兩天為致病免疫。本模型的優點［9］是造模簡單、陽性率高、重復性好，常被用于多發性腎炎的研究。缺點是病情反應較重，易導致部分動物中途死亡，同時在人的腎炎中，與這種模型相似的發病機制的病例很少，僅限肺出血-腎炎綜合征（Goodpasture綜合征）。
4 系膜增殖性
腎炎（MsPGN）模型機制有以下兩種，由細菌感染合并異種免疫蛋白聯合作用造成模型及單純異種免疫蛋白造成模型。朱聲永等［10］復制家兔膜增殖型腎炎模型（按北京醫科大學第一附屬醫院腎炎研究室介紹的方法復制），預免疫:每只家兔背部皮下注射牛血清白蛋白1 mg，每周1次，連續3次。第4周時每只家兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內毒素1 μg，共1次。正式免疫:第3周開始每只家兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白25 mg，每日1次，每周6次，共6周，并于最后1周中血清白蛋白劑量加倍注射。按照吳衡生法［11］制備兔模型，每只兔第1天從耳靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg。第4周分別從兔耳靜脈抽血做各項檢查。第8周后處死動物，做腎臟病理檢查，此病理改變與人類MsPGN極相似。由于兔模型費用昂貴，石志超等［12］制備大鼠血清白蛋白模型，即每只大鼠尾靜脈注射1 g/kg結晶性小牛血清白蛋白，7天造模成功。目前，國際上普遍采用抗Thy-1抗體誘導的腎炎模型研究人類系膜增殖性腎小球腎炎的發病機制?！翱筎hy-1抗體腎炎模型”可用抗Thy-1多克隆抗體或抗Thy-1單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）經靜脈注射大鼠而建立。如蔣文功等［13］對單克隆抗體OX-7誘導的系膜增殖性腎小球腎炎大鼠模型的研究，經大鼠尾靜脈單獨注射單克隆抗體OX-7（1 mg/kg），第7天模型制作成功。抗Thy-1單抗引起的腎病可能于1周后緩解，故馮媛等［14］用單側腎切除后3天按5 mg/kg體重靜脈注射磷酸鹽緩沖溶液溶解的Thy-1單抗1-22-3法造模。單純性MsPGN模型制作方法簡便易行，且病變穩定可靠，重復性好，因此越來越受到人們的重視。
5 血清病腎炎
模型它是一種經典的免疫復合物腎病模型，包括急性血清病腎炎和慢性血清病腎炎兩類：急性模型由一次性大劑量注入牛血清白蛋白抗原，使動物的免疫系統產生抗BSA抗體，并和循環中剩余的抗原結合，形成循環免疫復合物（CIC）滯留于腎臟。丁秋蘭等［15］按Dixon方法首先將牛血清白蛋白用生理鹽水溶解。按250 mg/ml劑量1次家兔耳靜脈注射，即成功制作急性兔腎毒血清性實驗模型。慢性模型由多次注入牛血清白蛋白（每日1次），使動物體內抗原持續對免疫系統形成刺激，隨著血清中抗BSA抗體的增多，可溶性CIC在循環中出現，分別沉積在腎小球毛細血管壁或系膜區，形成腎小球腎炎。楊解人等［16］選用新西蘭大耳白兔，耳緣靜脈注射C-BSA 10 mg，1次/d，共5周，第6周劑量加倍的方法成功制作家兔C-BSA腎炎模型。由于慢性血清病腎炎復制周期長、陽性率低，而急性血清病腎炎較慢性血清病腎炎模型方便省時且抗原消耗少，因而得到更為廣泛的應用。
6 氨基核苷腎病模型
此模型又名嘌呤霉素腎病，屬于腎毒性藥物導致腎損傷造成的腎炎模型。現常用［17，18］注射鹽酸阿霉素（ADR）、氯化汞、灌服碳酸鋰等制造模型。彭蘊茹等［19］用鹽酸阿霉素復制模型，大鼠一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素7.5 mg/kg，于第10天獲得滿意造模效果。
7 其他腎炎模型
如IgA腎病模型、局灶性節段性腎小球硬化模型、狼瘡性腎炎模型等。20世紀70年代末Rifai等用牛血清白蛋白（BSA）作為載體交聯二硝基苯酚（DNP）［6］；20世紀80年代初Isaacs等用帶不同電荷的右旋糖酐經腹腔靜脈注射，結果均誘發小鼠IgA腎病。劉志紅等［20］每周一次，連續3周給大鼠靜脈注射葡萄球菌腸毒素B（SEB）0.4 mg/kg成功地復制出IgA腎病模型。局灶性節段性腎小球硬化模型（嘌呤霉素＋一側腎切除＋嘌呤霉素法，或5/6腎切除等）。狼瘡性腎炎模型包括自發性腎炎小鼠模型及慢性移植物抗宿主病模型。這些腎炎模型由于臨床病理類型的發病較少見或模型制作的繁瑣復雜性而應用較少。綜上所述，腎小球腎炎動物模型的研究已經越來越細致和深入。其中馬杉腎小球腎炎模型因與人的發病機制相近，研究相對成熟和完善；而嘌呤霉素腎病腎小球腎炎模型的研究相對復雜和不易操作；陽離子牛血清白蛋白引起的腎炎模型的研究以其簡便、高效與病理相似性而被廣泛應用。另外，腎炎模型近十余年無新的研究進展，只是對原有模型的復制，如何找出既省時又經濟的模型更有利于腎炎機制的闡述，也成為實驗研究的迫切問題。
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牛血清白蛋白范文第4篇
關鍵詞：大豆莖葉；蛋白質含量；考馬斯亮藍染色法
中圖分類號：TS63 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）20-4610-03
蛋白質是一項質量和資源評價的重要指標[1]，用一種快速、準確、方便的方法來檢測蛋白質含量是必不可少的。近年來，許多學者用考馬斯亮藍染色法和其他方法對蛋白質含量進行了測定[2-9]。蛋白質中的酰胺基團與考馬斯亮藍染料中的陰離子結合使溶液顯藍色，測定效果可通過測定顯色穩定性等多個性狀指標進行全面客觀地評價。本試驗采用盆栽大豆，對大豆的莖葉蛋白質含量與大豆產量進行考察，通過分析它們之間的影響與關系，為今后大豆育種工作提供試驗方法。
1 材料與方法
1.1 材料
供試樣品為大豆莖葉（實驗室自制）。
牛血清白蛋白（進口分裝），購于上海億欣生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250（進口分裝），購于中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；其他試劑均為國產分析純試劑。
1.2 儀器
SHB-IIIS循環水式多用真空泵和抽濾裝置（鄭州長城科工貿有限公司）、EL303型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度計（美國瓦里安有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 蛋白質標準溶液的配制 準確稱取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為
1 mg/mL蛋白質標準液，4 ℃保存待用。
1.3.2 考馬斯亮藍G-250溶液的制備 稱取考馬斯亮藍G-250 100.0 mg于研缽中，取體積分數為95%的乙醇（下同）50 mL，從中取約10 mL加入研缽，將考馬斯亮藍G-250研成粉并溶解；輕輕將上層液體轉入500 mL燒杯中，再取10 mL乙醇溶液于研缽中研磨，同法收集，重復洗滌3次。最后用20 mL乙醇分次洗滌研缽，合并液體于燒杯中。取體積分數為85%濃磷酸100 mL分次加入燒杯再轉入
1 L容量瓶，定容，抽濾，得考馬斯亮藍G-250溶液。
1.3.3 標準曲線的繪制 分別吸取0.2～1.0 mL標準蛋白質溶液于10 mL試管中，各管補加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL考馬斯亮藍 G-250溶液，搖勻，放置 2 min，于595 nm 處測定其吸光度[7]。
1.3.4 樣品中蛋白質含量的測定 取樣品溶液0.1 mL，按上述方法測定其吸光度，再根據標準曲線方程計算出樣品的蛋白質含量[8]。
2 結果
2.1 標準曲線回歸方程的建立
用紫外分光光度計，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白對照，在595 nm處測定對照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線見圖1。
通過測定不同濃度牛血清白蛋白的吸光度得其線性回歸方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。
2.2 樣品蛋白質含量測定結果
按蛋白質含量測定方法，同時做3個重復，大豆莖的吸光度為0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆葉的吸光度為0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。計算大豆莖的蛋白質含量為7.608%、7.734%和7.677%，平均含量為7.673%；大豆葉的蛋白質含量為11.313%、11.305%和11.328%，平均含量為11.315%。
2.3 穩定性試驗
量取同一樣品溶液 1 mL，每隔 10 min 測定1次，觀測其穩定性，結果見表1，表明在顯色1 h 內吸光度穩定，RSD分別為0.04%和0.39%。
2.4 重復性試驗
按上述方法，分別測定大豆莖和葉蛋白提取液的吸光度，檢驗該方法的重現性，結果見表2，RSD分別為0.83%和1.27%，小于5%，表明重現性較好。
2.5 精密度試驗
準確吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL進行精密度試驗，連續測定其吸光度6次，其RSD為0.25%，小于5%，表明精密度較好，結果見表3。
2.6 回收率測定
取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆莖（或葉）樣品溶液，然后再加入5 mL考馬斯亮藍染色液，搖勻，靜置2 min左右，于595 nm處測定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作為空白對照，根據標準曲線算出相應濃度，然后計算加入樣品蛋白的量，并計算回收率[9]，結果見表4。結果表明，該方法準確度較高，可滿足大豆莖葉中蛋白含量的快速定量分析。
3 討論
蛋白質分子均具有酰胺基團，棕紅色的考馬斯亮藍G-250染料上的陰離子與蛋白質的酰胺基團結合，使溶液變為藍色，由于溶液在595 nm處吸光度與蛋白質含量成正比，因此595 nm處測定吸光度，可計算出樣品中蛋白質含量[6]。上述結果表明，考馬斯亮藍與蛋白質中的酰胺基團結合生成的藍色非常穩定，在1 h之內吸光度值變化很小，重復性較好，精密度較高，同時該方法測定蛋白含量的回收率符合大豆莖葉蛋白質含量的測定要求。大豆莖蛋白質提取液中蛋白質含量在0.7～1.0 mg/mL范圍內；大豆葉蛋白質提取液中蛋白質含量在1.1～2.0 mg/mL范圍內，用考馬斯亮藍染色法測定大豆莖葉蛋白質的含量優于其他傳統方法[10，11]。但另一方面，該法線性范圍窄，低濃度樣品易受影響，因此，在測定時所用試管須經酸浸泡，洗凈后應經高溫烘干。當樣品濃度大于一定濃度時，須稀釋測定，另外，可用乙醇和去離子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。綜上所述，該法準確率較高且簡便靈敏，對設備要求低，受干擾小，適宜于測定大豆莖葉的蛋白質含量。
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牛血清白蛋白范文第5篇
[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；白蛋白納米粒；處方優化；抗腫瘤
[Abstract] In this study， the tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles were prepared by high pressure homogenization method. The formulation was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM ）， with the particle size， encapsulation efficiency， and drug loading as indexes to investigate their in vitro anti-tumor effect. The results showed that the prepared nanoparticles had uniformly spherical morphology and uniform particle size distribution. The average particle size， encapsulation efficiency and drug loading of nanoparticles were about （175.7 ± 3.07） nm， 90.8%±1.47% and 5.52%±0.09%， respectively. Tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles showed a more powerful antitumor effect than free tanshinone ⅡA for human promyelocytic leukemia NB4 cells. The preparation method of the drug-loaded albumin nanoparticles was simple and easy， and can significantly improve the solubility of tanshinone ⅡA， so it was helpful to extend its application in therapies against hematological malignancies.
[Key words] tanshinone ⅡA； albumin nanoparticles； formulation optimization； anti-tumor effect
丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的一種脂溶性成分，其在心腦血管疾病、抗菌消炎、抗氧化等方面具有確切藥理作用[1]。研究發現，丹參酮ⅡA可抑制多種腫瘤細胞的生長，其對人早幼粒白血病細胞具有明顯增殖抑制作用[2]。然而丹參酮ⅡA水溶性差（溶解度僅為2 mg?L-1），口服生物利用度低（
1 材料
丹參酮ⅡA（純度>95%，南京狄爾格醫藥科技有限公司，批號D20150622A）；丹參酮ⅡA對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-15021504）；牛血清白蛋白（美國Amresco，純度>98%）；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Amresco公司；膽固醇（上海惠世生化試劑有限公司，批號151024）；精制蛋黃卵磷脂（德國Lipoid，批號510300-2153731/948）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。
高效液相色譜儀 Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）；ALC-110.4型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；UV-2450紫外分光光度計（SHIMADZU 日本島津公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀（英國Malvern）；拓普超純水機（成都超純科技有限公司）；EF-C5 高壓均質機（加拿大Avestin公司）；HENC高速剪切儀（德爾特混合設備有限公司）；冷凍干燥機（美國Labconco公司）。
2 方法與結果
2.1 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的制備
稱取200 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于20 mL超純水中，超聲溶解，作為水相；另稱取20 mg丹參酮ⅡA 、40 mg膽固醇、40 mg蛋黃卵磷脂溶于0.9 mL的氯仿中，超聲溶解，作為油相。在高速剪切儀的作用下，將油相緩慢地注入水相中，高速剪切8 min，制備得到粗乳，迅速將粗乳轉移至高壓均質機中，均質10次，在35 ℃下，減壓真空除去氯仿，最終得到白蛋白納米粒膠體溶液[6]。
2.2 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的藥劑學特性表征
2.2.1 形態學觀察 取適量丹參酮ⅡA白蛋白納米粒溶液，加水稀釋后，滴加在覆蓋碳膜的銅網上，用20 g?L-1磷鎢酸負染樣品后，自然晾干后于透射電鏡下觀察，結果見圖1。由圖1可見，納米粒形態較為圓整，粒徑較均勻。
2.2.2 粒徑分布與Zeta電位 采用激光粒度分析儀對所制備的白蛋白納米粒的粒徑、分散系數（PDI）及Zeta電位進行測定，其平均粒徑為（175.7±3.07） nm，PDI為（0.187±0.04），Zeta電位為（-22.2±0.62） mV（n=3）。
2.3 包封率和載藥量的測定
2.3.1 色譜條件[7] 色譜柱Cosmonsil C18 烷基硅膠鍵合相（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（75∶25）；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm；流速1.0 mL?min-1；進樣量20 μL；檢測波長270 nm。方法的專屬性良好；回歸方程為Y=118.82X+69.15，r=0.999 9。丹參酮ⅡA在16～80 mg ?L-1與對應的色譜峰面積線性關系良好；精密度和重復性RSD分別為0.78%，0.67%；平均加樣回收率為99.7%，RSD為1.2%。
2.3.2 白蛋白納米粒樣品的處理 精密量取按2.1項下制得的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒1.0 mL于5 mL量瓶中，加入0.5 mL 0.01 mol?L-1鹽酸，用無水乙醇定容，搖勻，超聲5 min，0.22 μm微孔濾膜精濾，按2.3.1項下色譜條件測定峰面積，計算。
2.3.3 包封率和載藥量的測定 參考文獻[8]方法，取200 μL的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒注入G25葡聚糖凝膠柱，用超純水洗脫，待棕紅色納米粒洗脫至凝膠柱底端時，用離心管接收白蛋白納米粒洗脫液，直至其完全被洗脫（約5 mL）。將上述納米粒洗脫液按2.3.2項下方法處理，進樣HPLC檢測，即可測得被包封的藥物量We，另取同等體積未過柱分離的白蛋白納米粒，稀釋至與總洗脫液相同的體積，再取稀釋后的納米粒按2.3.2項下方法處理，同法操作，即可得白蛋白納米粒中藥物總量Wt。將納米粒在制備時的投藥量記為Wa，血清白蛋白及藥用輔料的總量為Wd。包封率（EE）公式為EE=（We/Wt）×100%；載藥量（DLE）公式為DLE=（Wa×EE）/（Wa+Wd）×100%。
2.4 溶解度的測定
在2.1項下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒中加入3%的甘露醇，溶解后，轉移至-80 ℃冰箱冷凍24 h，然后迅速轉移至冷凍干燥機中凍干36 h，得到納米粒凍干粉。將過量的丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA白蛋白納米粒凍干粉加入到5 mL水中，平行操作3次，超聲后，于（37± 0.5） ℃恒溫振搖24 h，平衡后，4 000 r?min-1離心10 min[9]。取上清液0.5 mL，按2.3.2項下方法，提取丹參酮ⅡA，進樣測定。根據實驗結果得出丹參酮ⅡA及其白蛋白納米粒制劑在水中的溶解度分別為（2.31±0.03），（708±1.15） mg?L-1（n=3）。
2.5 制劑處方優化
2.5.1 星點設計-效應面法優化處方[10] 參考預實驗中的單因素試驗結果，將剪切時間設為8 min，均質次數設為10次，有機相體積設為0.9 mL，附加劑（膽固醇和蛋黃卵磷脂）的比例設為1∶1，采用星點設計-效應面法考察牛血清白蛋白質量（A）、附加劑質量（B）和丹參酮ⅡA質量（C）對載藥白蛋白納米粒粒徑（Y1）、包封率（Y2）及載藥量（Y3）的影。使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對3因素分別設定5水平，各因素水平見表1。以Y1，Y2和Y3共同作為評價指標，每個指標均標準化為“0～1”之間的“歸一值（desirability，di）”。公式為OD=（d1d2……dk）1/k ，k為指標數。其中，對于取值越大越好的指標（如包封率、載藥量）和取值越來越小的指標（如粒徑）分別按公式dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）和dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）計算各指標的di[11]。實驗安排及結果見表2。
2.5.2 模型擬合與方差分析 使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對上表數據進行二次多項式擬合，擬合方程為Y1=467.063 91-0.622 64A-2.743 66B-11.550 99C-0.003 012 5AB+0.015 35AC-方差分析結果顯示，該二項式擬合模型F為4.37，PC>A，交互項AB，AC和BC對指標的影響均不顯著，二次項A2影響不顯著，而二項式B2和C2影響顯著，由此可說明各因素間的交互作用較小。該二次項擬合模型擬合效果良好，且具有顯著性，可作為丹參酮ⅡA白蛋白納米粒處方優化預測模型。
2.5.3 等高線圖及效應面圖綜合分析 固定牛血清白蛋白質量、附加劑質量、藥物質量3個因素中任意一個，考查其他2因素交互作用對OD值的影響，結果見圖2。由圖可知，在3個因素中，對于OD影響最大的是附加劑的質量，其次是藥物質量，而白蛋白質量的影響相對很小。在一定范圍內，隨著附加劑質量的增加，OD呈非線性減小趨勢，表現為曲面較陡；而隨著白蛋白質量的增加，OD呈線性增加趨勢，表現為曲面較平滑。
根據Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對試驗結果進行系統分析，得出在擬定工藝條件下的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的最佳處方：牛血清白蛋白200 mg、附加劑的質量80 mg、丹參酮ⅡA質量20 mg。預測在此處方條件下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的粒徑為173.3 nm，包封率為90.1%，載藥量為5.48%，OD為0.869。
2.5.4 方驗證[12] 按照以上優化處方平行制備3批樣品，結果見表4。由表4可見，實際所得白蛋白納米粒的粒徑與預測值相差（二者之差除以預測值）1.37%，包封率與預測值相差0.75%，載藥量與預測值相差0.73%。結果表明，該模型可以準確的預測白蛋白納米粒的質量特性參數。另制劑學特性表征均按照最優處方進行測定。
2.6 體外抗腫瘤活性評價
2.6.1 白蛋白納米粒的細胞毒性 參考文獻[13]方法，選擇對數生長期的人早幼粒細胞白血病NB4細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，取100 μL的細胞懸液接種于96孔板，在96孔板孔中，分別加入100 μL細胞培養基以避免邊緣效應，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的孵箱中培養12 h過夜。每孔加入經RPMI 1640培養基稀釋的空白載體溶液（白蛋白濃度依次為200，100，50，25，5 mg?L-1，每個濃度設置3個復孔）40 μL，同時設置不加載體的對照組（含細胞）及調零孔（不含細胞），然后置孵箱中培養48 h。實驗結束前4 h，每孔加入MTT液（5 g?L-1）20 μL，37 ℃培養4 h，每孔加入100 μL SDS，放置過夜后，置酶聯免疫檢測儀于570 nm測定各孔的吸光度（A），按公式“細胞存活率=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%”計算細胞存活率。結果為經不同濃度白蛋白納米粒處理的細胞，其存活率為90%±0.84%（n=3），表明空白納米粒對細胞幾乎無毒性。
2.6.2 載藥納米粒的抗腫瘤作用 細胞鋪板同2.5.1項。用培養基將載藥白蛋白納米粒稀釋至50，25，12.5，6.25，3.12 mg?L-1（每個濃度設置3個復孔）加入96孔板中，后續操作同2.5.1項。同時用培養基將丹參酮ⅡA儲備液稀釋至與載藥白蛋白納米粒相同濃度作為對照考察，結果見圖3。游離丹參酮ⅡA和載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒對NB4細胞的殺傷作用均具有濃度依賴性，且載藥白蛋白納米粒的細胞毒性顯著強于游離丹參酮ⅡA，IC50分別為（10.43±0.12），（5.69±0.04） mg?L-1（n=3）。
3 討論
血清白蛋白是一種安全、無毒、生物相容、可降解的廣泛存在于血液中的蛋白質，這些特性使其成為一種良好的載體材料[14]。目前制備白蛋白納米粒的方法主要有超聲乳化法、去溶劑化法以及蛋白結合技術。其中去溶劑化法是制備白蛋白納米粒常用的方法，但作者在預實驗中發現，丹參酮ⅡA在無水乙醇中溶解度差，無法形成載藥納米粒，故采用蛋白結合技術制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒。蛋白結合技術指的是在高速剪切力作用下，載藥的有機溶劑以納米液滴的形式分布于白蛋白水溶液中，在均質過程中產生的空穴和熱效應，會引起血清白蛋白的二硫鍵橋聯而形成納米粒[15]。與去溶劑化法制備的白蛋白納米粒相比，其制備工藝簡單，包封率和載藥量較高，可實現規模化生產。另在預實驗中發現，加入一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇可顯著降低納米粒的粒徑，這可能是由于它們的存在提供了親脂性的微環境，增加了難溶性藥物丹參酮ⅡA與白蛋白的結合作用[16]。由溶解度測定結果可知丹參酮ⅡA在水中的溶解度為2.31 mg?L-1，而以白蛋白納米粒的制劑形式其溶解度可達到708 mg?L-1，與其水溶性相比提高了近300倍，較好地解決了丹參酮ⅡA的難溶性問題。在體外細胞實驗中，載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒較游離藥物表現出更優的抑瘤效果，這可能是由于白蛋白納米粒提高了丹參酮ⅡA的溶解度以及腫瘤細胞對白蛋白納米粒具有較強的攝取能力，從而增加了丹參酮ⅡA在腫瘤細胞內的聚集，發揮藥物的抗腫瘤功效[17]。
綜上，本研究采用高壓均質法制備得到的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，不僅提高了其溶解度，還增強了其抗腫瘤藥效，將有助于拓展丹參酮ⅡA在抗血液腫瘤方面的應用。
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