智能化抗酸桿菌檢測(cè)在結(jié)核診斷中應(yīng)用

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摘要：目的探討智能化抗酸桿菌檢測(cè)在結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用。方法收集１５０例肉芽腫性改變的石蠟包埋組織，同時(shí)進(jìn)行手工抗酸染色和自動(dòng)抗酸染色，分別進(jìn)行人工閱片病理診斷。使用自主開(kāi)發(fā)的結(jié)核桿菌識(shí)別人工智能（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｎｄｅｒ，ＴＢＦｉｎｄｅｒ）作為初篩，另請(qǐng)病理醫(yī)師復(fù)核１５０張自動(dòng)抗酸染色切片并作出病理診斷，分析兩種染色模式的效率及準(zhǔn)確率。結(jié)果１５０例智能化平臺(tái)染色的陽(yáng)性率為２９３％（４４／１５０），傳統(tǒng)模式染色的陽(yáng)性率為６６％（１０／１５０）。染色加診斷全流程智能化平臺(tái)每張切片耗時(shí)１２ｍｉｎ，傳統(tǒng)模式每張切片耗時(shí)５７ｍｉｎ，智能化平臺(tái)節(jié)約時(shí)間成本約７８％。結(jié)論智能化抗酸桿菌檢測(cè)平臺(tái)的應(yīng)用可提高病理醫(yī)師的工作效率和診斷準(zhǔn)確率，有助于規(guī)范質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：結(jié)核；抗酸染色；病理診斷；智能化；傳統(tǒng)

結(jié)核病是結(jié)核桿菌感染導(dǎo)致的慢性傳染病，我國(guó)結(jié)核病病例數(shù)居全球前列，其防治工作是醫(yī)療人員的重要任務(wù)［１］。結(jié)核病的治愈率和疫情的有效控制需具有及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷，檢測(cè)結(jié)核桿菌的手段多種多樣，其中抗酸染色又稱為ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ染色［２］。長(zhǎng)期以來(lái)抗酸染色的操作和診斷均為人工完成，染色質(zhì)量難以保證，診斷不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且陽(yáng)性率低。近年隨著全自動(dòng)染色機(jī)在病理科的應(yīng)用，抗酸染色切片質(zhì)量明顯提高，在一定程度上提高了病理醫(yī)師檢測(cè)陽(yáng)性桿菌的工作效率，但其費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的瓶頸仍未能得到突破。本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)ＣＮＮ平臺(tái)的結(jié)核桿菌識(shí)別人工智能（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｎｄｅｒ，ＴＢＦｉｎｄｅｒ），作為抗酸染色病理檢測(cè)的初篩手段，在臨床試驗(yàn)中具有高度敏感性和較高的特異性，為徹底解決結(jié)核桿菌抗酸染色病理診斷的難題提供強(qiáng)有力的工具［３］。本文將Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ全自動(dòng)染色和ＴＢＦｉｎｄｅｒ應(yīng)用于抗酸染色的病理診斷，創(chuàng)建智能化抗酸桿菌檢測(cè)模式，對(duì)比其與傳統(tǒng)抗酸桿菌檢測(cè)模式（手工染色＋人工閱片）的實(shí)驗(yàn)效率、染色質(zhì)量和診斷準(zhǔn)確率，探討智能化抗酸桿菌檢測(cè)在結(jié)核病理診斷中的價(jià)值及流程優(yōu)化。

１材料與方法

１．１材料

收集２０１９年７月～２０２０年７月北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科診斷肉芽腫性病變的石蠟包埋標(biāo)本１５０例，常規(guī)４５μｍ厚切片。每例均帶已確定抗酸陽(yáng)性的對(duì)照組織，７０℃烤片４０ｍｉｎ。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

１．２儀器與試劑

１．２．１儀器。Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ自動(dòng)染色機(jī)，Ｓｕｋｕｒａ封片機(jī)，標(biāo)簽打印機(jī)，Ｌｅｉｃａ切片機(jī)，Ｌｅｉｃａ水浴，Ｌｅｉｃａ烤片臺(tái)，３ＤＨＩＳＴＥＣＨ掃描儀。１．２．２試劑。堿性復(fù)紅，無(wú)水乙醇，石碳酸，亞甲基藍(lán)，１％鹽酸乙醇，蘇木精，Ｄｅｐａｒ脫蠟液，ＬＣＳ液，Ｗａｓｈ清洗液，蒸餾水等。

１．３實(shí)驗(yàn)方法

１．３．１手工染色。操作步驟：（１）切片脫蠟至水；（２）入石碳酸復(fù)紅液１ｈ，入３７℃或５６℃溫箱孵育３０ｍｉｎ；（３）蒸餾水洗凈；（４）０５％鹽酸乙醇分化；（５）蒸餾水洗，用０１％亞甲基藍(lán)水溶液復(fù)染１０ｍｉｎ；（６）蒸餾水洗，經(jīng)９５％乙醇分化；（７）１００％乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固［３］。１．３．２Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ全自動(dòng)染色。（１）檢查：開(kāi)機(jī)后檢查機(jī)器是否運(yùn)轉(zhuǎn)正常，查看緩沖試劑桶內(nèi)的試劑及廢液桶，確保有能夠完成當(dāng)次染色的液位；（２）備片：在電腦中選擇需要的染色項(xiàng)目方案，打印標(biāo)簽，貼于切片，制片并烘干；（３）運(yùn)行：將玻片平放在染色托上，標(biāo)簽側(cè)朝外，組織朝上，確定四角鎖定好后關(guān)閉載片倉(cāng)，將染色項(xiàng)目試劑放入試劑臺(tái)，打開(kāi)試劑蓋，點(diǎn)擊“運(yùn)行”，機(jī)器自動(dòng)掃描每張玻片和試劑，電腦顯示工作狀態(tài)圖為黃色并出現(xiàn)倒計(jì)時(shí)，染色自動(dòng)開(kāi)始；（４）完成：工作狀態(tài)圖為綠色，取下玻片，運(yùn)行清洗項(xiàng)目（圖１）。

１．４病理診斷

１．４．１人工診斷。由兩位病理醫(yī)師分別閱片、作出病理診斷；診斷一致的病例，記錄為最終診斷；診斷不一致的病例，共同閱片、討論、達(dá)成一致，作為該病例的最終診斷。１．４．２智能化診斷。采用ＴＢＦｉｎｄｅｒ初篩＋病理醫(yī)師復(fù)核的模式。（１）采用３ＤＨＩＳＴＥＣＨ掃描儀掃描抗酸染色切片，數(shù)字切片提交ＴＢＦｉｎｄｅｒ。（２）ＴＢＦｉｎｄｅｒ初篩采用兩階段模型設(shè)計(jì)，第一階段為目標(biāo)檢測(cè)階段，目的為識(shí)全切片圖像上的所有桿菌候選物，采用具備Ｓｔａｔｅｏｆｔｈｅａｒｔ性能的目標(biāo)檢測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ＲｅｔｉｎａＮｅｔ基礎(chǔ)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并加入可變卷積、Ｓｗｉｓｈ激活函數(shù)、半精度訓(xùn)練等優(yōu)化設(shè)計(jì)。采用包圍框標(biāo)注記錄桿菌在截圖上的頂點(diǎn)位置，最終模型在測(cè)試集上達(dá)到ｍＡＰ＠０５＝０８８。第二階段為分類(lèi)階段，根據(jù)第一階段的檢測(cè)結(jié)果將整張切片分為陰性、陽(yáng)性。從第一階段的檢測(cè)結(jié)果中選出置信度最高的１０個(gè)桿菌候選物，將檢測(cè)框置信度、檢測(cè)框大小作為特征值輸入ＳＶＭ模型。根據(jù)５００例具有活檢診斷記錄的抗酸桿菌切片，其中２００例原始診斷為桿菌陽(yáng)性、３００例診斷為陰性，采用６∶２∶２的數(shù)據(jù)拆分比例，模型在測(cè)試集上達(dá)敏感性１００％和特異性７６％。（３）病理醫(yī)師復(fù)核：ＴＢＦｉｎｄｅｒ標(biāo)注的陽(yáng)性桿菌，病理醫(yī)師對(duì)數(shù)字圖片進(jìn)行復(fù)核，有疑問(wèn)的病例在光鏡下進(jìn)行驗(yàn)證。（４）最終病理診斷：ＴＢＦｉｎｄｅｒ初篩為陰性者為抗酸陰性；ＴＢＦｉｎｄｅｒ初篩為陽(yáng)性者，需經(jīng)病理醫(yī)師在數(shù)字切片或光鏡下確認(rèn)，仍為陽(yáng)性者為抗酸陽(yáng)性（圖２），反之為抗酸陰性［４］。

１．５染色切片質(zhì)量評(píng)估

由兩位病理醫(yī)師分別對(duì)手工和自動(dòng)染色切片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)椎：（１）整體顏色：顏色不一致１分，一致性好２分；（２）菌體顏色：淺紅色１分，紫紅色２分（陰性病例的評(píng)分參考陽(yáng)性對(duì)照組織）；（３）背景顏色：不著色１分，藍(lán)色２分；（４）脫片：部分脫片１分，無(wú)脫片２分；（５）污染：有雜質(zhì)１分，無(wú)雜質(zhì)２分。上述各項(xiàng)評(píng)分相加為總評(píng)分：５分為差，６～８分為良，９～１０分為優(yōu)［５］，取兩位醫(yī)師評(píng)分的平均值作為該切片的最終評(píng)分。

２結(jié)果

２．１抗酸檢測(cè)陽(yáng)性率

１５０例樣本經(jīng)智能化檢測(cè)模式的陽(yáng)性率為２９３％（４４／１５０），傳統(tǒng)檢測(cè)模式的陽(yáng)性率為６６％（１０／１５０）。２．２切片質(zhì)量評(píng)分手工染色１５０例，切片質(zhì)量評(píng)分５～１０分，平均７８分，優(yōu)９８張，良４５張，差７張，優(yōu)良率９５３％（優(yōu)６５３％、良３０％）。自動(dòng)染色１５０例，切片質(zhì)量評(píng)分７～１０分，平均８９分，優(yōu)１１２張，良３８張，差０張，優(yōu)良率１００％（優(yōu)７４７％、良２５３％）；兩者差異有顯著性（Ｐ＜００５）。

２．３效率

（１）染色：手工染色全流程耗時(shí)約１１０ｍｉｎ（含脫蠟），自動(dòng)染色約４８ｍｉｎ，自動(dòng)染色節(jié)約時(shí)間６２ｍｉｎ。手工染色，一次最多染４～８張，自動(dòng)染色一次通量為２０張。（２）診斷：人工閱片每張切片平均耗時(shí)３０ｍｉｎ，ＴＢＦｉｎｄｅｒ則只需２ｍｉｎ，另行切片掃描和人工復(fù)核，智能化系統(tǒng)每張切片平均耗時(shí)１０ｍｉｎ。（３）染色＋診斷全流程：智能化平臺(tái)每張切片耗時(shí)１２ｍｉｎ，傳統(tǒng)模式每張切片耗時(shí)５７ｍｉｎ，智能化平臺(tái)節(jié)約時(shí)間成本約７８％。

２．４人工閱片和ＴＢＦｉｎｄｅｒ閱片的比較

１５０例機(jī)染切片，醫(yī)師人工閱片陽(yáng)性２１例。ＴＢＦｉｎｄｅｒ閱片陽(yáng)性５４例，不一致病例３３例，均為人工閱片陰性，ＴＢＦｉｎｄｅｒ閱片陽(yáng)性。

３討論

長(zhǎng)期以來(lái)抗酸染色均為手工完成，存在不穩(wěn)定因素較多，對(duì)操作者的技術(shù)要求高，導(dǎo)致染色質(zhì)量難以控制。結(jié)核桿菌長(zhǎng)度僅約４μｍ，直徑不足１μｍ，是影響結(jié)核病理診斷的主要因素［５－６］。因此，提高抗酸染色切片質(zhì)量，降低尋找陽(yáng)性桿菌的難度，是提升抗酸染色在結(jié)核病理診斷中應(yīng)用價(jià)值的兩大要素。人工智能源于１９５６年美國(guó)召開(kāi)的人工智能達(dá)特茅斯夏季研討會(huì)［７］，ＣＮＮ是近年發(fā)展的一種非常高效的人工智能，尤其在圖像識(shí)別領(lǐng)域取得驚人的突破，同時(shí)具備高效率、客觀穩(wěn)定、長(zhǎng)時(shí)間高負(fù)荷工作等優(yōu)點(diǎn)。與復(fù)雜的組織細(xì)胞形態(tài)相比，結(jié)核桿菌形態(tài)簡(jiǎn)單，識(shí)別難度小，將人工智能引入抗酸染色切片的初篩可提高檢出率。本課題組根據(jù)ＣＮＮ平臺(tái)自主研發(fā)的結(jié)核桿菌識(shí)別人工智能ＴＢＦｉｎｄｅｒ，作為抗酸染色病理檢測(cè)的初篩手段，具有高度敏感性和較高的特異性［４］。盡管人工智能在尋找抗酸桿菌的工作中具有顯著優(yōu)勢(shì)，但其適應(yīng)能力遠(yuǎn)不如病理醫(yī)師，因此一致性好、色彩鮮亮、對(duì)比度好的染色切片是其發(fā)揮強(qiáng)大工作能力的基礎(chǔ)。手工染色切片受多種不確定因素的影響，嚴(yán)重影響了人工智能的工作效率。Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ全自動(dòng)染色機(jī)是由染色模塊、緩沖液模塊、廢液收集模塊于一體的統(tǒng)一機(jī)械化運(yùn)行，從而確保染色環(huán)境的相對(duì)封閉，減少了人為和外界環(huán)境變化的干擾，同時(shí)恒量的液體滴加和標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械操作，使每一次染色的濃度均能保持一致，最終保證了切片顏色的均勻性和一致性。本組１５０例石蠟樣本，每個(gè)樣本連續(xù)切片２張，平行進(jìn)行手工抗酸染色和自動(dòng)抗酸染色，自動(dòng)染色組（平均分８９分、優(yōu)良率１００％）切片染色質(zhì)量評(píng)分高于手工染色組（平均７８分、優(yōu)良率９５３％）。因此，與手工染色相比，自動(dòng)染色更能匹配人工智能的應(yīng)用，順應(yīng)了人工智能時(shí)代病理發(fā)展的潮流。本組將Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ全自動(dòng)染色和ＴＢＦｉｎｄｅｒ整合應(yīng)用于抗酸染色的病理診斷，創(chuàng)建智能化抗酸桿菌檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)比傳統(tǒng)抗酸桿菌檢測(cè)模式（手工染色＋人工閱片），病理診斷陽(yáng)性率明顯提高（智能化模式２９３％ｖｓ傳統(tǒng)模式６６０％），且染色過(guò)程節(jié)約了時(shí)間成本，ＴＢＦｉｎｄｅｒ初篩又為病理醫(yī)師節(jié)約了大量閱片時(shí)間。本組結(jié)果顯示，染色加診斷全流程，智能化平臺(tái)比傳統(tǒng)模式節(jié)約時(shí)間成本約７８％。先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用極大提升了生產(chǎn)力，但卻并非完全替代人的作用。首先，在染色環(huán)節(jié)，由于機(jī)器的工作是連續(xù)不間斷的，出現(xiàn)錯(cuò)誤需從新開(kāi)始，降低效率。因此，應(yīng)做好前期的準(zhǔn)備工作，尤其是標(biāo)簽準(zhǔn)備、廢液桶及試劑瓶液位、染色試劑的剩余完成次數(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)需操作人員重點(diǎn)關(guān)注。為保證機(jī)器穩(wěn)定、高效的運(yùn)行，經(jīng)常維護(hù)，定期清洗，注意試劑ｐＨ值的把控，嚴(yán)格規(guī)范操作等細(xì)節(jié)都是必不可少的。其次，自動(dòng)化雖然降低了人的勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了工作效率，但制作優(yōu)質(zhì)的抗酸染色切片仍需實(shí)驗(yàn)人員具備高度的責(zé)任心和精益求精的工作作風(fēng)。最后，病理診斷必須由病理醫(yī)師完成。本實(shí)驗(yàn)人工閱片和ＴＢＦｉｎｄｅｒ判讀結(jié)果不一致者３３例（２２％），將其病例的ＴＢＦｉｎｄｅｒ標(biāo)注圖像由病理醫(yī)師復(fù)核，其中２３例為真陽(yáng)性，不一致的原因是人工閱片漏診所致；其中１０例ＴＢＦｉｎｄｅｒ找到的陽(yáng)性菌不在肉芽組織和壞死中，被醫(yī)師判為非致病菌，屬于假陽(yáng)性。由此可見(jiàn)，在實(shí)際應(yīng)用中病理醫(yī)師應(yīng)認(rèn)識(shí)到ＴＢＦｉｎｄｅｒ的局限性，尤其是無(wú)法鑒別致病菌和非致病菌。因此，ＴＢＦｉｎｄｅｒ的檢測(cè)結(jié)果必須經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)核確認(rèn)后，才能作出抗酸染色陽(yáng)性的診斷。綜上所述，由自動(dòng)染色、人工智能組成的智能化抗酸桿菌檢測(cè)平臺(tái)，不僅提高了工作效率，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少漏診率，提高結(jié)核的檢出率，還有助于規(guī)范質(zhì)量控制和減少環(huán)境污染，使抗酸染色在結(jié)核診斷中發(fā)揮重要作用，值得臨床推廣。

作者:趙業(yè) 張凱聞 梁麗 熊焰 李挺 單位:北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科